Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algen vorgelegt von Diplom-Lebensmittelchemiker Sven Klimmek Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften -Dr. rer. nat.- genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Berichter: Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Rotard Prof. Dr. rer. nat. Hans-Jürgen Stan Prof. Dr. rer. nat. Rainer Buchholz Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 17.06.2003 Berlin 2003 D 83 Abstract In der vorliegenden Arbeit wurden Grundlagenkenntnisse über den nartürlichen Prozess der Biosorption von Schwermetallen an Algen erarbeitet. Die Untersuchungen fanden im Rahmen des Sonderforschungsbereich (Sfb) 193 "Biologische Behandlung industrieller und gewerblicher Abwässer" der Technischen Universität Berlin statt. Ausgangspunkt der Arbeit stellten Untersuchungen an der Chlorophyceae C. vulgaris dar. In einem anschließenden Screening, das sich aus der Charakterisierung der Biosorption an C. vulgaris ableitete, wurden 30 weitere Algen aus unterschiedlichen taxonomischen Klassen auf ihre Sorptionsfähigkeiten gegenüber den Schwermetallen Blei, Cadmium, Nickel und Zink untersucht. Die einzelnen Algen zeigten eine große Bandbreite in den Biosorptionsleistungen. Zu den leistungsfähigsten Arten zählten die Chlorophyceae C. salina, die Cyanophyceae S. hofmani und L. taylorii. Die Biosorptionseigenschaften von C. salina und L. taylorii wurden im weiteren näher untersucht. L. taylorii zeigte im Verlauf der Arbeit besondere Eigenschaften und konnte erfolgreich in ein technisches Verfahren im Kooperationsprojekt überführt werden. Die Untersuchungen an dieser Alge wurden aus diesem Grund um Kupfer erweitert. Die maximalen Kapazitäten an L. taylorii wurden mit 0,4 mmol Cd; 0,7 mmol Cu; 0,7 mmol Ni; 1,47 mmol Pb und 0,5 mmol Zn pro g Alge (Pb > Cu ≥ Ni > Zn > Cd) bestimmt. Das Gleichgewicht zwischen den in Lösung befindlichen Metallen und an der Alge gebundenen war bei C. salina und L. taylorii praktisch nach 30 min eingestellt. Die beiden Algen zeigten eine ähnliche pH-Abhängigkeit gegenüber den Metallen. So waren ab einem pH-Wert von 3 (pH 4 bei Ni an L. taylorii) bis pH 6 bzw. pH 5 bei Cu an L. taylorii die Beladungen für die Schwermetalle annähernd konstant. Sinkt der pH unter 3 so nimmt die Beladung deutlich ab. Die Metalle können bei saurem pH-Wert (0,1 N HCl) von den Algen desorbiert werden. Selektivitätsuntersuchungen der Metalle an beiden Algen zeigten eine deutliche Präferenz der Bindung von Blei gegenüber den anderen Metallen aus äquimolaren Lösungen. In Hinblick auf eine Beeinflussung der Biosorptionseigenschaften der Algen, ist die Kenntnis der chemischen Vorgänge während der Biosorption der Metalle sehr wichtig. Verschiedene chemische und spektroskopische Verfahren wurden zur Charakterisierung eingesetzt. So führte eine gezielte Veresterung der freien Carboxylgruppen der Algenpolysaccharide zu einer deutlichen Erniedrigung der Beladung für die Metalle. FT-IR spektroskopische Untersuchungen und Versuche zur pH-Abhängigkeit unterstrichen die Bedeutung dieser schwach sauren funktionellen Gruppe in der Algenzellwand für die Biosorption. Rasterelektronenmikroskopie (REM) in Kombination mit einer Röntgenmikroanalyse bestätigte, dass die Schwermetalle an der Oberfläche der Algen gebunden sind. Aus den Röntgenspektren der unbeladenen Alge L. taylorii wurden überraschend hohe Gehalte an Calzium auf der Oberfläche entdeckt. Erneute Untersuchungen der Biosorption der Schwermetalle an L. taylorii in Hinblick auf Calzium in der Lösung ergaben, dass die Schwermetalle im direkten Austausch mit Calzium an der Alge gebunden werden. Somit stellt ein Ionenaustauschprozess den Hauptmechanismus bei der Biosorption an L. taylorii dar. Mit dem Ziel einer Erhöhung der Kapazitäten bzw. einer Beeinflussung der Selektivitäten wurden Experimente zum Einbau zusätzlicher funktioneller Gruppen in die Zellwandpolysaccharide der Algen durchgeführt. Eine Phosphorylierung der freien OH-Gruppen der Algenzellwand von L. taylorii mit Phosphorsäure in einer Harnstoffschmelze stellte die erfolgreichste Modifizierungsmethode in dieser Arbeit dar. Der Phosphorgehalt stieg von 0,5 mmol/g auf 4,4 mmol/g bei der phosphorylierten Alge an. Der Anstieg der Phosphorgehalte bewirkte eine enorme Erhöhung der Bindungskapazitäten. Aus den Adsorptionsisothermen an L. taylorii ergaben sich maximalen Beladungen von 2,5 mmol Cd; 2,4 mmol Cu; 2,8 mmol Ni; 3,1 mmol Pb und 2,6 mmol Zn pro g Biotrockenmasse (Pb > Ni > Zn > Cd > Cu). Die erreichten Beladungen stellen die höchsten in dieser Arbeit beobachteten Beladungen dar. Danksagung Die experimentellen Arbeiten für die vorliegende Dissertation wurden in der Zeit von Januar 1997 bis Dezember 2000 am Institut für Lebensmittelchemie der Technischen Universität Berlin durchgeführt. Sie wurden mir durch die finanzielle Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 193 "Biologische Behandlung industrieller und gewerblicher Abwässer" Teilprojekt F2 ermöglicht. Meinem Doktorvater, Prof. Dr. Hans-Jürgen Stan danke ich herzlich für die Betreuung der Arbeit, seine stets vorhandene Diskussionsbereitschaft und die großzügige Unterstützung in allen wissenschaftlichen und organisatorischen Fragen. Mein besonderer Dank gilt ferner den Kooperationspartnern im Sonderforschungsbereich für die konstruktive Zusammenarbeit in all den Jahren. Prof. Dr. Buchholz möchte ich darüber hinaus für die Unterstützung und Begutachtung der vorliegenden Arbeit danken. Dr. Gerald Bunke und Dr. Andreas Wilke waren mir durch ihre stete Hilfsbereitschaft und vor allem durch die zahlreichen fachlichen Diskussionen unersetzliche Begleiter während dieser Arbeit. Meiner Mitarbeiterin Constanze Richter sei an dieser Stelle für die hervorragende Hilfe bei der Bewältigung der zahlreichen Analysen während des Projektes gedankt. Ohne sie wäre die Bearbeitung des Projektes in diesem Zeitraum nicht möglich gewesen. Am Gelingen dieser Arbeit waren Janko Bartsch, Kristina Thron und Gunnar Lang durch ihre Beiträge im Rahmen von Studien- bzw. Praktikumsarbeiten maßgeblich beteiligt, wofür ich ihnen sehr danke. Für die Durchführung der Elementaranalysen sei Dr. Schulz vom Institut für Organische Chemie der Humboldt Universität zu Berlin gedankt. Herrn Jörg Nissen vom Zelmi der TU Berlin möchte ich für die Aufnahmen am Rasterelektronenmikroskop danken. Allen Kolleginnen und Kollegen aus dem Arbeitskreis sei an dieser Stelle für die konstruktive und freundliche Arbeitsatmosphäre gedankt. Ursula Wippo, die mich während meiner Diplomarbeit sehr unterstützte und mir die ersten Schritte im Arbeitskreis erleichterte, sei für ihre stete Hilfsbereitschaft und fachliche Diskussionsfreude herzlich gedankt. Meinen Kollegen Dr. Corinna Asmussen und Dr. Patrick Billian sei für ihre vielseitige Hilfe, vor allem bei der Bewältigung der organisatorischen Herausforderungen im Rahmen des Sonderforschungsbereiches sehr gedankt. Darüber hinaus möchte ich mich bei Robert Hatton für seine Hilfe in allen englischen Fragestellungen bedanken. Für ihre Kompetenz und Hilfe in allen praktischen Laborangelegenheiten und im besonderen für alle aufmunternden Gespräche über den Laboralltag hinaus danke ich Dagmar Simmert. Ein besonderes Dankeschön geht an meine Eltern, die mich während meines Studiums der Lebensmittelchemie immer tatkräftig unterstützt haben. Meiner Frau Antje sei für ihre Unterstützung und Liebe in all den gemeinsamen Jahren unendlich gedankt. Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Publikationen Wilke, A.; Klimmek, S.; Stan, H.-J.; Bunke, G.; Buchholz, R. (2002): Development of an Immobilisation Method based on Sodium Cellulose Sulphate for Biosorption of Lead with Cyanophyceae L. taylorii. Environ. Sci. Technol. Submitted Klimmek, S.; Wilke, A.; Bunke, G.; Buchholz, R.; Stan, H.-J. (2001): Characterization of the Biosorption of Cadmium, Lead, Nickel and Zinc by Algae. Environ. Sci. Technol. 35 (21): 4283-4288 Klimmek, S.; Stan, H.-J. (2000): Chemical Characterization of the Biosorption of Heavy Metals by Algae. Schriftenreihe Biologische Abwasserreinigung, Band 14: Behandlung von Abwässern mit schwermetallhaltigen Verbindungen, TU-Berlin, 209-227 Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999a): Chemische Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algen. Abwassertechnik in der Produktion, 5 / 6.9, 1-6 Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999b): Untersuchungen zur Schwermetalladsorption an Mikroalgen. Lebensmittelchemie 53: 103 Vorträge Klimmek, S.; Stan, H.-J. (2001): Biosorption of heavy metals by algae. 4th International Symposium on Green Chemistry, 21.-24. Mai, Jinan, China Klimmek, S.; Stan, H.-J. (2000a): Chemical Characterization of the Biosorption of Heavy Metals by Algae. 10. Kolloquium des Sonderforschungsbereichs 193 der TU Berlin: Behandlung von Abwässern mit schwermetallhaltigen Verbindungen, 20.-21. November, Berlin Klimmek, S.; Stan, H.-J. (2000b): Chemical Characterization of the Biosorption of Heavy Metals. 2000 Conference on Hazardous Waste Research, 23.–25. Mai, Denver, Colorado Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999a): Chemische Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algenbiomasse. 7. Ungarisch-Deutsches Seminar für Verfahrenstechnik der TU Berlin, 3. September, Berlin Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999b): Untersuchungen zur Schwermetalladsorption an Mikroalgen. Regionalverbandstagung der Regionalverbände Nord und Nordost der GDCh, 19. – 20. April, Frankfurt/Oder Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1998a): Chemische Charakterisierung der Biosorption von Blei, Cadmium, Nickel und Zink an Algen. 8. Jahrescolloquium der IGAS, 11. November, Berlin Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1998b): Chemische Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algen. Interne Arbeitssitzung des GVC/Dechema-Fachausschusses "Produktionsintegrierte Wasser-/Abwassertechnik" , 31. August, Bremen Posterpräsentationen Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999a): Untersuchung der Adsorption von Blei, Cadmium, Nickel und Zink an Algen. 4. GVC-Abwasser-Kongreß, 06.– 09. September, Bremen Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999b): Schwermetalladsorption an Algen. 17. Jahrestagung der Biotechnologen, 27.-29. April, Wiesbaden Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1999c): Untersuchung der Adsorption von Blei, Cadmium, Nickel und Zink an Algen. Colloquium Analytische Atomspektroskopie, 14.-19. März, Konstanz Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1998a): Chemische Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algen. Colloquium: Produktionsintegrierte Wasser-/ Abwassertechnik, „Abwässer der Metallverarbeitenden Industrie und des Transportgewerbes“, 01.–02. September, Bremen, Universität Bremen Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1998b): Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Algen. Firmengemeinschaftsstand Berlin zur Entsorga ‘98, 12.- 16. Mai , Köln Klimmek, S.; Stan, H.-J. (1997): Charakterisierung der Biosorption von Schwermetallen an Mikroalgen. Forschungsforum ‘97, Gemeinschaftsstand des Sonderforschungsbereiches 193 der TU Berlin, 16. - 20. September, Leipzig I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................VI Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................... VIII Tabellenverzeichnis ..................................................................................................................XI 1 Einleitung............................................................................................................................1 2 Grundlagen .........................................................................................................................2 2.1 Schwermetalle .......................................................................................................2 2.1.1 Blei ........................................................................................................................3 2.1.2 Cadmium ...............................................................................................................4 2.1.3 Kupfer....................................................................................................................4 2.1.4 Nickel ....................................................................................................................5 2.1.5 Zink........................................................................................................................6 2.2 Algen .....................................................................................................................6 2.2.1 Taxonomie.............................................................................................................7 2.2.2 Kultivierung von Algen .........................................................................................9 2.2.3 Zusammensetzung der Algenzellwand................................................................11 2.2.4 Technologische Bedeutung von Algen................................................................13 2.3 Verfahren zur Schwermetallentfernung ..............................................................14 2.3.1 Konventionelle Verfahren ...................................................................................14 2.3.1.1 Grundlagen der Adsorption ..............................................................................15 2.3.1.2 Grundlagen von Ionenaustauschern .................................................................17 2.3.2 Biosorption ..........................................................................................................18 2.3.2.1 2.3.2.2 3 Mechanismus der Biosorption ..........................................................................21 Möglichkeiten für den industriellen Einsatz .....................................................22 Problemstellung und Lösungsansätze ..........................................................................23 II 4 Material und Methoden .................................................................................................25 4.1 Materialien...........................................................................................................25 4.1.1 Algenbiomasse ....................................................................................................25 4.1.2 Vergleichssorbenzien ..........................................................................................26 4.2 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren........................................27 4.2.1 Atomabsorptionsspektroskopie ...........................................................................27 4.2.1.1 4.2.2 Interferenzen in der GF-AAS ............................................................................29 Gaschromatographie (GC)...................................................................................30 4.2.2.1 Statische Headspace-Gaschromatographie......................................................31 4.2.2.2 Flammenionisationsdetektion ...........................................................................32 4.2.3 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)...................................................32 4.2.3.1 Hochleistungsanionenaustauschchromatographie (HPAEC) mit elektrochemischer Detektion.............................................................................33 4.2.3.1.1 Gepulster amperiometrischer Detektor (PAD) ...........................................33 4.2.4 FT-IR Spektroskopie ...........................................................................................34 4.2.5 Rasterelektronenmikroskopie (REM)- Röntgenmikroanalyse ............................35 4.3 Metallanalytik – Methodenentwicklung..............................................................37 4.3.1 GF-AAS...............................................................................................................37 4.3.2 Mikrowellenaufschluss........................................................................................38 4.3.3 Flammenphotometrie...........................................................................................39 4.4 Biosorptionsuntersuchungen – Methodenentwicklung .......................................39 4.4.1 Probenvorbereitung .............................................................................................39 4.4.2 Biosorptionsversuche ..........................................................................................39 4.4.2.1 Kinetik der Biosorption.....................................................................................40 4.4.2.2 Aufnahmen von Isothermen...............................................................................40 4.4.2.3 pH- und Salz-Abhängigkeit der Biosorption.....................................................41 III 4.4.2.4 Selektivität der Biosorption...............................................................................41 4.4.2.5 Anwendung der Biosorption auf ein reales Bleiabwasser ................................41 4.5 Charakterisierung der Bindungstellen – Methodenentwicklung .........................41 4.5.1 Elementaranalyse.................................................................................................42 4.5.2 Bedeutung von Carboxylgruppen für die Biosorption ........................................42 4.5.2.1 Blockierung der Carboxylgruppen ...................................................................42 4.5.2.2 Bestimmung des Carboxylgruppengehalts........................................................42 4.5.2.2.1 Analyse des Methanols mittels HS-GC-FID ..............................................42 4.5.3 Untersuchung der Polysaccharide der Algenzellwände ......................................43 4.5.4 Extraktion von Zellwandbestandteilen ................................................................45 4.5.4.1 Lipophile Extraktion .........................................................................................45 4.5.4.2 Hydrophile Extraktion ......................................................................................46 4.5.4.3 Alkalische Extraktion ........................................................................................46 4.5.5 FT-IR Spektroskopie ...........................................................................................46 4.5.6 Spezifische Oberfläche ........................................................................................46 4.5.7 Rasterelektronenmikroskopie (REM)..................................................................46 4.6 Modifizierung der Biomasse - Methodenentwicklung ........................................47 4.6.1 Phosphorylierung mit Phosphorsäure..................................................................47 4.6.2 Phosphorylierung mit Phosphorylchlorid............................................................47 4.6.3 Phosphorylierung mit Phosphorpentasulfid ........................................................47 4.6.4 Carboxymethylierung mit Chloressigsäure .........................................................48 4.6.5 Einbau von Carboxylgruppen durch eine zweistufige Oxidation........................48 5 Ergebnisse .......................................................................................................................49 5.1 Biosorptionsuntersuchungen ...............................................................................49 5.1.1 5.1.1.1 Biosorption von C. vulgaris ................................................................................49 Adsorptionsisothermen .....................................................................................49 IV 5.1.1.2 Kinetik ...............................................................................................................51 5.1.1.3 pH-Abhängigkeit ...............................................................................................51 5.1.2 Screening .............................................................................................................52 5.1.3 Biosorption von C. salina....................................................................................55 5.1.3.1 Adsorptionsisothermen .....................................................................................55 5.1.3.2 Kinetik ...............................................................................................................57 5.1.3.3 pH-Abhängigkeit ...............................................................................................58 5.1.3.4 Selektivität der Bindung von Blei, Cadmium, Nickel und Zink.........................59 5.1.4 Biosorption von L. taylorii ..................................................................................61 5.1.4.1 Adsorptionsisothermen – L. taylorii .................................................................61 5.1.4.2 Kinetik ...............................................................................................................63 5.1.4.3 pH-Abhängigkeit der Biosorption.....................................................................64 5.1.4.4 Selektivität der Bindung von Blei, Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink............65 5.1.4.5 Einfluss von Fremdsalzen auf die Biosorption an L. taylorii ...........................68 5.1.4.6 Reinigung eines bleihaltigen Abwasser mit L. taylorii .....................................70 5.1.5 Vergleichssorbenzien ..........................................................................................71 5.1.5.1 Screening...........................................................................................................71 5.1.5.2 Dowex 22 ..........................................................................................................73 5.1.5.3 Carbion .............................................................................................................74 5.2 Charakterisierung der Bindungsstellen................................................................76 5.2.1 Elementaranalyse der Biosorbenzien ..................................................................76 5.2.2 Bedeutung von Carboxylgruppen für die Biosorption ........................................79 5.2.3 Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung der Zellwände....................81 5.2.4 Extraktion verschiedener Zellwandbestandteile..................................................82 5.2.5 Charakterisierung der Oberfläche........................................................................85 5.2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM)................................................................85 5.2.5.2 Bedeutung von Calzium bei der Biosorption an L. taylorii ..............................88 V 5.2.5.3 FT-IR Spektroskopie .........................................................................................88 5.2.5.4 Spezifische Oberfläche......................................................................................89 5.3 Modifizierung der Biomasse ...............................................................................90 5.3.1 Screening von Methoden zur Einführung von funktionellen Gruppen in die Zellwandstrukturen von Algen ............................................................................90 5.3.2 Synthese von phosphorylierter L. taylorii ...........................................................92 5.3.3 Charakterisierung der modifizierten L. taylorii...................................................96 5.3.4 Biosorptionseigenschaften von L. taylorii phos. .................................................97 5.3.4.1 5.3.4.2 Kinetik ...............................................................................................................99 5.3.4.3 pH-Abhängigkeit .............................................................................................100 5.3.4.4 Selektivität der Metallbindung........................................................................101 5.3.4.5 6 Adsorptionsisothermen – L. taylorii phos.........................................................97 Einfluss von Fremdsalzen auf die Biosorption ...............................................104 Zusammenfassung und Diskussion ............................................................................106 6.1 Biosorptionsuntersuchungen .............................................................................106 6.2 Charakterisierung der Bindungstellen ...............................................................112 6.3 Modifizierung der Biomasse .............................................................................117 7 Ausblick.........................................................................................................................122 8 Literatur .........................................................................................................................123 Anhang ..................................................................................................................................133 A Metallanalytik.....................................................................................................133 B Biosorptionsuntersuchungen ..............................................................................137 C Charakterisierung der Bindungsstellen...............................................................138 D Modifizierung der Biomasse ..............................................................................142 VI Abkürzungsverzeichnis ε0 Normalpotential A Freundlichexponent AAS Atomabsorptionsspektrometrie oder -spektrometer Abb. Abbildung Abs Absorbance B Langmuirkonstante BTM Biotrockenmasse Ca Calzium Cd Cadmium ceq Gleichgewichtskonzentration Cu Kupfer d Dichte EN Elektronegativität F Fläche FD Filmdicke FID Flammenionisationsdetektor FT-IR- Fourier-Transform-Infrarot- g Gramm GC Gaschromatographie GF – AAS Graphitrohrofen (graphite furnace) – Atomabsorptionsspektrometrie oder -spektrometer HKL Hohlkathodenlampe HPAEC Hochleistungsanionenaustauschchromatographie (high performance anion exchange chromatography) HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography) HS-GC Headspace-Gaschromatographie ID Innendurchmesser ISTD interner Standard k Freundlichkonstante Kap. Kapitel M molare Masse MAK Maximale Arbeitsplatzkonzentration max. Maximale Na Natrium VII Ni Nickel P Phosphor PAD gepulster amperiometrischer Detektor (pulsed amperiometric detector) Pb Blei ppb parts per billion (µg / L) ppm parts per million (mg / L) qeq Gleichgewichtsbeladung qmax maximale Beladung nach Langmuir 2 r Bestimmtheitsmaß RE Rückstreuelektronen REM Rasterelektronenmikroskopie Rf Responsefaktor rion Ionenradius RSD relative Standardabweichung (relative standard deviation) RT Raumtemperatur SE Sekundärelektronen Tab. Tabelle TiC Gesamt anorganischer Kohlenstoffgehalt (Total inorganic carbon) TOC Gesamt organischer Kohlenstoffgehalt (Total organic carbon ) V Volumen Vinj Injektionsvolumen Zn Zink VIII Abbildungsverzeichnis Abb. 2–1: Struktur ausgewählter saurer Polysaccharide (Kloareg und Quatrano, 1988) ....13 Abb. 4–1: Messzelle des PAD (Firma Dionex)....................................................................34 Abb. 4–2: HPAEC-PAD-Chromatogramme von Standardmischungen...............................44 Abb. 4–3: HPAEC-PAD-Chromatogramm der hydrolysierbaren Kohlenhydrate von C. salina ...................................................................................................................45 Abb. 5–1: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris ................................................................................................................49 Abb. 5–2: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir ......................................................50 Abb. 5–3: Kinetik der Metallbindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris......................51 Abb. 5–4: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris ..........52 Abb. 5–5: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina .....56 Abb. 5–6: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir ......................................................56 Abb. 5–7: Kinetik der Metallbindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina.........................57 Abb. 5–8: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina..............58 Abb. 5–9: Konkurrenz der Bindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina............................60 Abb. 5–10: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii .................................................................................................................61 Abb. 5–11: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir ........................................62 Abb. 5–12: Kinetik der Metallbindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii.................63 Abb. 5–13: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii .....64 Abb. 5–14: Konkurrenz der Bindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii ...................66 Abb. 5–15: Einfluss von Natriumionen auf die Biosorption an L. taylorii ............................68 Abb. 5–16: Einfluss von Calciumionen auf die Biosorption an L. taylorii............................69 Abb. 5–17: Kapazitäten der Sorbenzien im Verhältnis zu C. salina und L. taylorii..............72 IX Abb. 5–18: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an Dowex 22...73 Abb. 5–19: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an Carbion ......74 Abb. 5–20: Einfluss einer Methylierung der Carboxylgruppen auf die Biosorption .............79 Abb. 5–21: Einfluss verschiedener Extraktionen auf die Biosorption an C. salina ...............83 Abb. 5–22: Einfluss verschiedener Extraktionen auf die Biosorption an L. taylorii .............84 Abb. 5–23: REM - Röntgenanalyse an C. salina ...................................................................86 Abb. 5–24: REM - Röntgenanalyse an L. taylorii..................................................................87 Abb. 5–25: Verteilungsbilder von Pb, Cd, Ni und Zn auf der Oberfläche von L. taylorii.....87 Abb. 5–26: FT-IR Spektren von C. salina und L. taylorii .....................................................89 Abb. 5–27: Einfluss der Reaktionszeit bei 170 °C auf die Ausbeute, Pb-Beladung und P-Gehalt von L. taylorii phos. .............................................................................93 Abb. 5–28: Einfluss der Harnstoffkonzentration auf die Ausbeute, Pb-Beladung und PGehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C) ...........................................................93 Abb. 5–29: Einfluss der Phosphorsäurekonzentration auf die Ausbeute, Pb-Beladung und P-Gehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C).................................................94 Abb. 5–30: Einfluss der eingesetzten Mengen an Harnstoff und Phosphorsäure auf die Ausbeute, Pb-Beladung und P-Gehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C)..........95 Abb. 5–31: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Ausbeute, Pb-Beladung und PGehalt von L. taylorii phos..................................................................................95 Abb. 5–32: FT-IR-Spektren von L. taylorii und L. taylorii phos. ..........................................96 Abb. 5–33: REM - Röntgenanalyse an L. taylorii phos. ........................................................97 Abb. 5–34: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos........................................................................................................97 Abb. 5–35: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir ................................98 Abb. 5–36: Kinetik der Metallbindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. .......99 Abb. 5–37: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos....................................................................................................................100 Abb. 5–38: Konkurrenz der Bindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos.........102 X Abb. 5–39: Einfluss von Natriumionen auf die Biosorption an L. taylorii phos..................104 Abb. 5–40: Einfluss von Calciumionen auf die Biosorption an L. taylorii phos. ................105 Abb. 6–1: Screening der Biosorption von Pb, Cd, Ni und Zn an 31 Algen .......................107 Abb. 6–2: Reaktionsgleichung nach Daul et al. (1954) für die Phosphorylierung der OH-Gruppen ......................................................................................................118 XI Tabellenverzeichnis Tab. 2–1: Physiko-chemische Eigenschaften ausgewählter Schwermetalle .........................2 Tab. 2–2: Grenzwerte ausgewählter Schwermetalle..............................................................4 Tab. 2–3: Übersicht der Taxonomie der Algen (Hoek et al., 1995) ......................................8 Tab. 2–4: Aufbau und Vorkommen wichtiger saurer Polysaccharide.................................12 Tab. 2–5: Bindungskapazität ausgewählter Biosorbenzien .................................................20 Tab. 4–1: Untersuchte Algen ...............................................................................................25 Tab. 4–2: Vergleichssorbenzien ..........................................................................................27 Tab. 4–3: Arbeitsbereiche der untersuchten Metalle mittels GF-AAS................................38 Tab. 5–1: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an C. vulgaris..........................50 Tab. 5–2: Biosorptionseigenschaften im Screening von 31 Algenarten..............................53 Tab. 5–3: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an C. salina .............................57 Tab. 5–4: Selektivität der Metallbindung an C. salina ........................................................59 Tab. 5–5: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an L. taylorii............................62 Tab. 5–6: Selektivität der Metallbindung an L. taylorii ......................................................67 Tab. 5–7: Chemische Zusammensetzung eines Abwassers aus der Akkumulatorenindustrie ......................................................................................70 Tab. 5–8: Kapazitäten für Cd, Pb, Ni und Zn an Vergleichssorbenzien..............................72 Tab. 5–9: Langmuirparameter für die Adsorptionsiosthermen an Dowex 22 .....................73 Tab. 5–10: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an Carbion...............................75 Tab. 5–11: Elementaranalyse (C, H, N, S und P) der Algen .................................................76 Tab. 5–12: Elementaranalyse (C, H, N, S und P) der Vergleichssorbenzien ........................78 Tab. 5–13: Gehalt an Carboxylgruppen in den unbehandelten und behandelten Algen .......80 Tab. 5–14: Monosaccharidzusammensetzung der Zellwände ausgewählter Algen ..............81 Tab. 5–15: Bedeutung von Calzium bei der Biosorption an L. taylorii.................................88 Tab. 5–16: Ergebnisse der Modifizierungen an der Algenbiomasse .....................................91 Tab. 5–17: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an L. taylorii phos. ..................99 XII Tab. 5–18: Selektivität der Metallbindung an L. taylorii phos............................................103 Tab. A–1: Geräteparameter der GF-AAS ...........................................................................133 Tab. A–2: Parameter des optischen Systems des GF-AAS ................................................133 Tab. A–3: Temperaturprogramme für die Metalle .............................................................134 Tab. A–4: Parameter des Mikrowellenaufschlusssystem ...................................................135 Tab. A–5: Aufschlussprogramm der Algenbiomasse.........................................................135 Tab. A–6: Geräteparameter des Flammenphotometers ......................................................135 Tab. A–7: Chemikalien und Materialien – Anhang A........................................................136 Tab. B–1: Chemikalien, Materialien und Geräte – Anhang B ...........................................137 Tab. B–2: Parameter der Küvettentests von der Dr. Lange GmbH....................................138 Tab. C–1: Chemikalien, Materialien und sonstige Geräte – Anhang C .............................138 Tab. C–2: Geräteparameter der HS-GC-FID......................................................................140 Tab. C–3: Geräteparameter der HPAEC-PAD...................................................................140 Tab. C–4: Geräteparameter der FT-IR-Spektroskopie .......................................................141 Tab. C–5: Geräteparameter der REM-Röntgenmikroanalyse ............................................142 Tab. D–1: Chemikalien, Materialien und Geräte– Anhang D ............................................142 Einleitung 1 1 Einleitung Die Kenntnis ökotoxikologischer Wirkungen sowie verschärfte gesetzliche Auflagen zur Reduzierung industrieller Emissionen erfordern neue Verfahren zur Abwasserbehandlung. Die Belastung unserer Oberflächengewässer mit Schwermetallen gehört heute zu den großen Umweltproblemen in Deutschland und anderen Industriestaaten. Als Folge früherer teilweise unkritischer Bewertung von Industrieeinleitungen befinden sich in allen Flüssen größere Deponien an Schwermetallen gebunden im Flusssediment. Neben diffusen Quellen, die für den Eintrag von Metallen in gelöster Form und als Stäube in die Umwelt verantwortlich sind, werden große Anteile der Schwermetalleinträge durch industrielle Abwässer verursacht, die ungenügend gereinigt in die Vorfluter gelangen. Praktisch stellen jeder metallverarbeitende Betrieb aber auch viele andere Industriebetriebe punktuelle Emissionsquellen dar. Es besteht kein Zweifel, dass diese Schadstoffsenke nicht unbegrenzt belastet werden kann und das die Gefahr besteht, dass bei Veränderung der Umweltbedingungen im Oberflächengewässer, die abgelagerten Schwermetalle ins Wasser freigesetzt werden und ihre biozide Wirkung entfalten können (Förstner und Salomons, 1991). Deshalb muss jeder weitere Eintrag vermieden werden. Konventionelle Technologien der Schwermetallentfernung, wie chemische Fällung, Ionenaustausch oder elektrochemische Verfahren, sind vor allem im unteren Konzentrationsbereich häufig weder effektiv noch ökonomisch (Wilde und Beneman, 1993). Im Sonderforschungsbereich (Sfb) 193 "Biologische Behandlung industrieller und gewerblicher Abwässer" der Technischen Universität Berlin werden seit 1997 Grundlagenkenntnisse über die Ausnutzung des natürlichen Prozesses der Biosorption von Schwermetallen an Algen für die Abwasserreinigung erarbeitet. Der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit liegt in der Entwicklung von Methoden zur chemischen Charakterisierung der Biosorptionsvorgänge der Schwermetalle an ausgesuchten Algen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. R. Buchholz am Institut für Biotechnologie der TU Berlin konnten diese Ergebnisse auf ein anwendungsorientiertes Verfahren zur Abwasserreinigung übertragen werden. 2 Schwermetalle 2 Grundlagen 2.1 Schwermetalle Schwermetalle sind ubiquitär verbreitet und stellen die umfangreichste Gruppe der Metalle dar (> 40 Elemente des Periodensystems). Es sind Metalle, deren spezifisches Gewicht mindestens 5 g / cm3 beträgt. Die meisten Schwermetalle kommen in der Natur nur in sehr geringen Konzentrationen vor. Einige dieser Metalle sind als Spuren- und Mikronährstoffe für den Stoffwechsel von Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere essentiell (Chrom, Kupfer, Eisen, Selen), so z.B. als Bestandteile von Metallproteinen in Enzymen. Andererseits wirken eine Vielzahl von Schwermetallen als elementarer Staub, aber besonders in Form der löslichen Salze schon in sehr geringen Konzentrationen toxisch. Die Schwermetalle gelangen durch natürliche Prozesse (Vulkane, Verwitterung), aber überwiegend durch antropogene Prozesse in Folge der Industrialisierung (Rauchgase, Industrieabwässer, Sondermüll, Autoabgase) in die Umwelt (Römpp, 1992). Dem Bereich Industrieabwasser kommt dabei eine entscheidende Rolle zu. Tab. 2–1: Physiko-chemische Eigenschaften ausgewählter Schwermetalle Cda Cu Ni Pb Zn Ordnungszahl 48 29 28 82 30 Gruppeb II. N I. N VIII. N IV. H II. N M (g/mol) 112,41 63,55 58,69 207,2 65,39 d (g/cm3) 8,642 8,92 8,91 11,34 7,14 rion (Å)c 1,09 0,87 0,83 1,33 0,88 ENd 1,46/1,7 1,75/1,9 1,75/1,9 1,55/1,9 1,66/1,6 ε0 (V)e -0,403 +0,34 -0,257 -0,125 -0,763 a Holleman und Wiberg, 1995 Einordnung im Periodensystem der Elemente (H-Hauptgruppe, N-Nebengruppe) c Ionenradius der zweifach geladenen Kationen bei Koordinationszahl 6 d Allred-Rochow/Pauling e M → M2+ + 2 e- (pH=0) b Die in die Umwelt gelangten Metalle werden von den Primärproduzenten (Mikroorganismen, Pflanzen) angereichert und gelangen so in die Nahrungskette, an dessen Ende der Mensch steht. Auf Grund der gesundheitsgefährdenden Potentiale dieser Schadstoffe sollte auf ihren Einsatz verzichtet werden. Da dies oft aus technologischen Gründen nicht möglich ist, liegt es Grundlagen 3 in der Verantwortung aller, den Eintrag dieser Schadstoffe so niedrig wie möglich zu halten. Das wird leichter von den Verursachern akzeptiert und technisch realisiert, wenn die Kosten für die Abwasserreinigung nicht zu einer erheblichen Erhöhung der Produktionskosten führen. Die Entwicklung von Techniken zur effektiven und preisgünstigen Schwermetallentfernung bis zu sehr kleinen Restkonzentrationen sind deshalb von großem Interesse (Lahmann und Jander, 1987). Untersuchungen der Biosorption der industriell bedeutenden Schwermetalle Blei, Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink sind Schwerpunkt dieser Arbeit. Tab. 2–1 zeigt die physikalischen und chemischen Eigenschaften der ausgewählten Schwermetalle. 2.1.1 Blei Blei und seine Verbindungen werden bei zahlreichen industriellen Prozessen verwendet. Sie dienen z.B. zur Herstellung von Behältern für aggressive Flüssigkeiten, als Akkumulatorenmaterial, zur Herstellung von Farben, Verbundmaterialien und Munition. Die bis vor kurzem bedeutsamste Anwendung war der Zusatz von Bleitetraethyl zur Erhöhung der Klopffestigkeit von Kraftstoffen. Die beim Verbrennen entstandenen Bleisalze und -oxide gelangten als fein verteilte Aerosole in die Umwelt, die zu einer starken Umweltbelastung führten. Im Strahlenschutz wird Blei zur Absorption von Röntgen- und Gammastrahlen eingesetzt. (Holleman und Wiberg, 1995; Ewers und Schlipköter, 1991) Sowohl elementares als auch gebundenes Blei wirken für Organismen giftig, indem sie u.a. die Synthese des Hämoglobins bzw. Chlorophylls hemmen. Die Aufnahme des Bleis in den Körper erfolgt über den Magen-Darm-Trakt (10% Resorption) und über die Lunge (40-90% Resorption). Das Blei wird von den Erythrocyten des Blutes gebunden, transportiert und anstelle von Calzium in die Knochen eingebaut. Zusätzlich wird Blei in der Leber und in der Niere gespeichert. Die Halbwertzeit von Bleisalzen in den Knochen beträgt 20 Jahre. Bei einer chronischen Bleiexposition werden vor allem das zentrale und periphere Nervensystem (Degeneration der Nervenzellen ⇒ Lähmungen), das blutbildende System (Anämie) und die Nieren geschädigt. (Macholz und Lewerenz, 1989; Dekant und Vamvakas, 1994) Die Kumulation von Blei im Körper zeigt die Notwendigkeit zur Verhinderung weiterer Kontaminationen der Umwelt mit diesem Metall (Tab. 2–2). Der Gesetzgeber hat aus diesem Grunde Grenzwerte zum Schutz des Menschen und der Umwelt für eine Reihe von toxikologisch relevanten Schwermetallen festgelegt, um die Umwelt und den Menschen zu schützen. Eine Auswahl von wichtigen Grenzwerten für die hier relevanten Schwermetalle ist in Tab. 2–2 gegeben. 4 Tab. 2–2: Schwermetalle Grenzwerte ausgewählter Schwermetalle Cd Cu Ni Pb Zn Abwasser (mg/L)a 0,05 0,3 0,5 0,1 0,5 MAK-Wert (mg/m3)b 0,05 0,1c bzw. 1d - 0,1 - Trinkwasser (mg/L)e 0,005 3f 0,05 0,04 5f a Mindestanforderungen für Direkteinleiter nach §7a Wasserhaushaltsgesetz (WHG) (Lühr, 1994) Henschler (2000); c atembare Partikel von Cu und CuO (Staub); d feinstteilige Partikel von Cu und CuO (Rauch) e Dilly (1992) f Richtwert b 2.1.2 Cadmium Cadmium und seine Verbindungen haben bei einer Vielzahl von industriellen Prozessen große Bedeutung (z.B. Korrosionsschutz für Metalle, Herstellung von Farben, Batterien und Legierungen, Kernreaktortechnik, hier insbesondere Brems- und Kontrollstäbe). Durch diese intensive Nutzung wurde die Umwelt und damit auch die Nahrung des Menschen mit diesem toxischen Metall belastet. Bei einer jährlich um zehn Prozent steigenden Weltproduktion von Cadmium tragen vor allem die Erzverhüttung (Zinkgewinnung), eine unsachgemäße Entsorgung von Ni/Cd-Batterien und Klärschlämme zur Umweltbelastung bei. (Holleman und Wiberg, 1995; Stoeppler, 1991) Toxikologische Wirkungen auf den Menschen sind Schädigungen der Schleimhäute und der Lunge bei chronischer Exposition von Cadmium über die Atemwege und Schädigungen der Nieren bei chronischer Belastung der Nahrung mit Cadmium. Cadmium reichert sich im menschlichen Organismus an und seine Halbwertszeit beträgt 30 Jahre. Die Hauptspeicherorgane sind Niere und Leber, wobei die Konzentration in den Nieren bei niedrigen Cadmiumdosen bis zu zehnmal höher sind als in der Leber. Bei zusätzlichem Mangel von Calzium und Vitamin D wurden in Japan bei älteren Frauen starke Knochenschmerzen und Knochendeformationen beobachtet (Itai-Itai-Krankheit). Beim Menschen liegen die Cadmiumkonzentrationen in der Nierenrinde in vielen Regionen heute zehn- bis hundertmal höher als vor etwa 50 Jahren. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung für den Schutz der Umwelt vor einer weiteren Kontamination mit Cadmium (Tab. 2–2). (Macholz und Lewerenz, 1989; Dekant und Vamvakas, 1994) 2.1.3 Kupfer Kupfer ist dem Menschen als Werkstoff und Schmuckwerkstoff schon seit mehr als 9000 Jahren bekannt. Ca. 40% der jährlichen Kupferproduktion werden zur Herstellung von Kupferle- Grundlagen 5 gierungen verwendet. Aufgrund seiner hervorragenden elektrischen Leitfähigkeit wird ca. die Hälfte der jährlich erzeugten Kupfermengen in der Elektroindustrie eingesetzt. Da sich die elektrische Leitfähigkeit parallel zur Wärmeleitfähigkeit verhält, werden Braukessel, Vakuumpfannen, Lötkolben, Destillationsapparaturen, Heiz- und Kühlschlangen usw. in reinem Kupfer oder aus Kupferlegierungen hergestellt. In Form seiner Salze spielt Kupfer wegen der fungiziden Wirkung seit alters her eine bedeutende Rolle im Pflanzenschutz und in Holzschutzmitteln. (Holleman und Wiberg, 1995; Scheinberg, 1991) Kupfer stellt für den Menschen und höhere Tiere ein essentielles Spurenelement als Bestandteil von Kupferproteinen mit Enzymfunktion dar. Der tägliche Bedarf wird mit 1 bis 2,5 mg und der Gesamtkörperbestand mit 80 bis 120 mg angegeben. Kupfermangel führt zu einer Anämie. Die löslichen Kupferverbindungen sind für den Menschen und andere höhere Organismen nur mäßig giftig und wirken erst in höheren Dosen als Brechmittel. Auch kommt Ihnen ein gewisses mutagenes und carcinogenes Potential zu. Die Inhalation von Dämpfen und Rauch kann sogenanntes Metallfieber verursachen (MAK-Werte, Tab. 2–2). Dagegen stellen Kupferverbindungen für niedere Organismen bereits in geringen Konzentrationen ein starkes Gift dar. Die von Gesetzgeber festgelegten Grenz- bzw. Richtwerte für Kupfer sind in Tab. 2– 2 zusammengefasst. (Macholz und Lewerenz, 1989; Römpp, 1992). 2.1.4 Nickel Die Hauptmenge des erzeugten Nickels findet in Form von Legierungen Anwendung und wird insbesondere von der Stahlindustrie verbraucht, da durch Zusatz einiger Prozente Nickel zum Stahl dessen Härte, Zähigkeit und Korrosionsbeständigkeit stark erhöht wird, besonders in Kombination mit Chrom (Chromnickelstahl). Feinverteiltes Nickel kann bei höherer Temperatur beträchtliche Mengen Wasserstoff absorbieren, weshalb es als Hydrierungskatalysator (Raney-Nickel) eine wichtige Rolle spielt. Als letztes sei der Gebrauch von Nickel in Akkumulatoren erwähnt. (Holleman und Wiberg, 1995; Sunderman und Oskarsson, 1991) Nickel ist für den Menschen und viele andere Lebewesen essentiell. Der Mensch enthält ca. 0,014 mg Ni pro kg. Zur biologischen Rolle ist noch wenig bekannt, doch scheint es am Kohlenhydrat-Stoffwechsel beteiligt zu sein. Stäube, die Nickel oder Nickelverbindungen enthalten, sind sowohl stark toxisch als auch krebserzeugend und lösen bei empfindlichen Personen Dermatitis aus. Lösliche Nickelverbindungen sind beim Verschlucken magen- und darmreizend und können bei lokaler Exposition zu Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen führen. Ausgehend von dieser Toxizität wurden Grenzwerte für die zulässigen Konzentrationen an 6 Algen Nickelverbindungen in Ab- und Trinkwasser erlassen (Tab. 2–2). (Macholz und Lewerenz, 1989; Römpp, 1992) 2.1.5 Zink Die Hauptmenge des erzeugten Zinks wird zum Verzinken von Stahl (Korrosionsschutz) verwendet. Auch Anstrichstoffe mit hochpigmentierten Zinkstaubfarben und neutralen Bindemitteln werden zum Korrosionsschutz eingesetzt. Große Mengen Zink dienen ferner zur Erzeugung von Legierungen (z.B. Messing). Anwendungen bei der Herstellung von galvanischen Elementen, Druckplatten, als Ätzmittel im Textildruck und als Reduktionsmittel in der Metallurgie sind weiterhin von Bedeutung. (Holleman und Wiberg, 1995; Ohnesorge und Wilhelm, 1991) Für Menschen, Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen ist Zink essentiell (biologisch nach Eisen am wichtigsten). Der Mensch enthält durchschnittlich 40 mg Zink pro kg, wobei Zink Bestandteil von über 200 Enzymen ist. Der Erwachsene benötigt etwa 22 mg Zink pro Tag. Die Toxizität von Zink und den meisten Zinkverbindungen ist im allgemeinen gering. Größere Mengen von Zinksalzen (1-2 g) rufen jedoch äußerlich Verätzungen, innerlich stark schmerzhafte Entzündungen, Übelkeit und Erbrechen beim Menschen hervor. Zinkverunreinigungen in Industrie- und Haushaltsabwässern stellen ebenfalls ein nicht zu unterschätzendes Gefährdungspotential für die Umwelt dar, besonders in Hinblick auf gleichzeitige Kontamination dieser Abwässer mit begleitenden toxischen Schwermetallen (Blei, Cadmium). Einige Gefahren wurden für aquatische Organismen und Pferde bei erhöhter Zinkexposition beschrieben. Die von Gesetzgeber festgelegten Grenz- bzw. Richtwerte für Zink sind in Tab. 2– 2 zusammengefasst. (Macholz und Lewerenz, 1989; Römpp, 1992). 2.2 Algen Die Oberfläche der Erde wird zu rund zwei Dritteln von Ozeanen und Seen bedeckt, die bis zu einer Tiefe von 150 Metern von photosynthetisierenden Pflanzen, den Algen, bewohnt werden. Die Algen erbringen wahrscheinlich den größten Teil der Primärproduktion organischer Substanz auf der Erde. Algen sind nicht nur von großer ökologischer, sondern auch von phylogenetischer Bedeutung. Es wird vermutet, daß alle Gruppen der Tiere und Pflanzen im Meer entstanden sind, wo noch jetzt Vertreter uralter evolutionärer Linien zu finden sind. Grundlagen 2.2.1 7 Taxonomie Die Einteilung und Gliederung der Algen ist ein Prozess, der nicht als abgeschlossen zu betrachten ist, solange ein Fakt (Physiologie, Genetik) irgendeiner Species unbekannt ist. Um eine bessere Übersicht zu bekommen, wurde versucht die Algen zu klassifizieren. Das jeweilige Klassifikationssystem ist ein vom Menschen künstlich entwickeltes System, um komplexe Zusammenhänge verständlich darzustellen. Es kann deshalb nicht alle Merkmale der Organismen berücksichtigen. Dies gilt in besonderer Weise für die Algen. In den letzten Jahren wurde sowohl mit Hilfe der Elektronenmikroskopie als auch der Molekulargenetik eine umfangreiche Überarbeitung des traditionellen Algenklassifikationssystems durchgeführt. Eine detaillierte Darstellung dieser Klassifizierung würde den Rahmen dieser Arbeit sprengen. Trotzdem soll versucht werden, auf die generellen Strukturen einzugehen. Die obersten Unterscheidungsebenen sind Reiche, gefolgt von Abteilungen und Klassen. Diese enthalten meistens einen Hinweis auf die Farbe der in ihr eingeordneten Alge. Somit spielen Art und Zusammensetzung des Photosyntheseapparates eine entscheidende Rolle. Weitere Merkmale die zur Gruppeneinteilung führen, sind chemische Zusammensetzung der Reservestoffe und Zellwandzusammensetzung. Innerhalb der Algenabteilungen fasst man dann Gruppen zusammen, deren Merkmal beispielsweise eine analoge Fortpflanzung, Ernährungsweise, Ablauf der Lebenszyklen, Art der Begeißelung der Zellen oder Mitosetyp und Cytokinesetyp ist. In Tab. 2–3 ist die Gliederung der Algen dargestellt. (Hoek et al., 1995) In den weiteren Ausführungen werden nur die Abteilungen und Klassen näher vorgestellt, aus denen Arten in dieser Arbeit verwendet wurden. Die Abteilung der Cyanophyta (der Blaualgen) nimmt eine Sonderstellung in der Algenwelt ein, da sie dem Reich der Eubacteria (Prokaryota) zugeordnet wird. Blaualgen besitzen beispielsweise keinen Zellkern und keinen Golgi-Apparat. Deshalb wird zum Begriff Cyanophyta als Synonym Cyanobakteria verwendet. Der Abteilung Cyanophyta ist nur eine einzige Klasse untergeordnet, die Cyanophyceae. Diese Klasse enthält mehr als 150 Gattungen und 2000 Arten. Sie sind ubiquitär verbreitet. Eine sehr verbreitete und bekannte Art ist die Alge Microcystis aeruginosa. Dies ist eine Süßwasseralge. Sie verursacht in den Sommermonaten giftige Wasserblüten. Das Toxin von Microcystis aeruginosa (Microcystin genannt), ein cyclisches Polypeptid, verursacht Nekrose und Blutungen in der Leber. Es sind allerdings nicht alle Stämme dieser Alge toxisch. (Hoek et al., 1995; Graham und Wilcox, 2000) 8 Tab. 2–3: Algen Übersicht der Taxonomie der Algen (Hoek et al., 1995) Reich Abteilung Klasse* Eubacteria Cyanophyta Cyanophyceae Prochlorophyta Prochlorophyceae Glaucophyta Glaucophyceae Rhodophyta Bangiophyceae Eukaryota Florideophyceae Heterokontophyta Chrysophyceae Parmophyceae Sarcinochrysidophyceae Xanthophyceae Eustigmatophyceae Bacillariophyceae Raphidophyceae Dictyochophyceae Phaeophyceae Haptophyta Haptophyceae Cryptophyta Cryptophyceae Dinophyta Dinophyceae Euglenophyta Euglenophyceae Chloroarachniophyta Chloroarachniophyceae Chlorophyta Prasinophyceae Chlorophyceae Ulvophyceae Cladophorophyceae Bryopsidophyceae Dasycladophyceae Trentepohliophyceae Pleurastrophyceae Klebsormidiophyceae Zygnematophyceae Charophyceae * Algenarten aus den hervorgehoben (Fett) Klassen wurden in dieser Arbeit verwendet Die Abteilung der Rhodophyta, der Rotalgen, ist leicht von den anderen Abteilungen zu unterscheiden. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass es keine begeißelten Fortpflanzungszellen der Rotalgen gibt, dass das grüne Chlorophyll durch die Anwesenheit des akzessorischen photosynthetischen Pigments Phycobilin (Phycoerythirin und Phycocyanin) maskiert wird und die sogenannte Floridenstärke als wichtigster Reservestoff vorhanden ist. Die Einteilung der Rotalgen erfolgt in zwei Klassen. Die Bangiophyceae werden in weitere 5 Ordnungen (oder Familien) unterteilt. Zu ihren wichtigsten und am weitesten verbreiteten Vertretern gehören Bangiales und Porphyridiales. Die zweite Klasse bezeichnet man mit dem Namen Florideophyceae, die in 13 Ordnungen unterteilt ist. (Hoek et al., 1995; Graham und Wilcox, 2000) Grundlagen 9 Die Abteilung der Heterokontophyta umfasst 9 Klassen. Charakteristisch ist, dass die begeißelten Zellen heterokont sind, d.h., sie tragen eine lange, nach vorn gerichtete Flimmergeißel und eine kürzere, nach hinten gerichtete Geißel ohne Flimmern. Zur Klasse der Xanthophyceae (goldbraune Algen) werden etwa 100 Gattungen mit bis zu 600 Arten gezählt. Das wichtigste akzessorische Pigment ist Vaucheriaxanthin. Dieses Pigment ist ebenfalls bei der Klasse der Eustigmatophyceae bedeutend. In dieser Klasse sind nur wenige Gattungen und Arten bekannt, die in Süß- und Salzwasser vorkommen. Eine bedeutende Klasse stellen die Bacillariophyceae (Diatomeen, Kieselalgen) dar, die etwa 250 Gattungen mit 100000 Arten enthält. Kieselalgen kommen im Meer, in Süßwasser und auf feuchtem Boden vor. Das Phytoplankton der Ozeane besteht überwiegend aus Kieselalgen. Das wichtigste akzessorische Pigment ist Fucoxanthin. (Hoek et al., 1995; Graham und Wilcox, 2000) Die Chlorophyta, oder Grünalgen, umfassen eine der Hauptgruppen der Algen und sind in 11 Klassen unterteilt. Ihre Verbreitung erstreckt sich in alle belebten Bereiche der Erde und ihre Formenvielfalt erschließt alle Variationen. Die Abteilung Chlorophyta kann auf Grund seiner begeißelten Zellen, die isokont sind, d.h. sie tragen meistens zwei Geißeln, die gleich gebaut sind, sich aber in der Länge unterscheiden, leicht von den anderen Algenarten unterschieden werden. Schwieriger gestaltet sich die Abgrenzung der Chlorophyta von Moosen und Grünpflanzen. Die gesamte Abteilung enthält rund 500 Gattungen und etwa 8000 Arten. Zur Klasse der Chlorophyceae zählen etwa 355 Gattungen mit 2650 Arten. Die bekanntesten Vertreter dieser Klasse sind Arten der Gattung Chlorella, insbesondere Chlorella vulgaris, die durch ihre einfache Kultivierung in zahlreichen wissenschaftlichen Experimenten als Referenz eingesetzt wird. Die Bezeichnung Chlorella leitet sich von dem griechischen Wort „chloros“, grün und dem lateinischen „ella“ was klein bedeutet, ab. (Hoek et al., 1995; Graham und Wilcox, 2000) 2.2.2 Kultivierung von Algen Für die erfolgreiche Isolierung und Kultivierung einzelner Algenarten ist die Kenntnis geeigneter Nährlösungen bzw. Kulturmedien notwendig. Prinzipiell sollten diese dem natürlichen Biotop der jeweiligen Art in Bezug auf Ionengehalt und Ionenzusammensetzung entsprechen. Eine größere Zahl bewährter halb und vollsynthetischer Nährmedien sind in der Literatur (Schlösser, 1994) detailliert beschrieben und stehen je nach experimenteller Fragestellung zur Verfügung. Für experimentelle Untersuchungen sind vollsynthetische und klar definierte Nährlösungen von Vorteil, da sie die Reproduzierbarkeit der Kultivierung erhöhen. Die Be- 10 Algen deutung halbsynthetischer Kulturmedien liegt in der Stammhaltung mit minimalem Risiko für selektive Veränderungen und bei der Isolierung bisher nicht kultivierter und in ihren Ansprüchen nicht charakterisierter Algenarten. Oft variiert wird je nach Zielstellung einer Algenkultur die Nährstoffkonzentrationen im Verhältnis zur Wachstumsphase. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der pH-Wert der Kultivierung und das in diesem Zusammenhang eingesetzte Puffersystem der Nährlösung. Auch die Art der Nährstoffe spielt in diesem Zusammenhang eine Rolle. Liegt ein Nährstoff mehr als Anion vor (z.B. Stickstoff als Nitrat) so hat dessen Verbrauch einen Einfluss auf die Ionenbilanz. Die Mehrzahl der Algen ist auf eine ausreichende Versorgung mit Spurenelementen angewiesen. Es bietet sich die Verwendung von Erdextrakten an, da diese die benötigten Elemente in algenverfügbarer Form enthalten. Neben den Spurenelementen werden von einigen Algen auch Spurenstoffe (z.B. Vitamine) benötigt. Neben der ausreichenden Versorgung mit Nährstoffen sind für eine erfolgreiche Kultivierung optimale Lichtverhältnisse und Versorgung mit einer anorganischen Kohlenstoffquelle (CO2) notwendig. (Graham und Wilcox, 2000; Kohl und Nicklisch, 1988) Die Kultivierungsverfahren lassen sich in homogene und heterogene, sowie nach dem Modus der Nahrlösungzugabe in diskontinuierliche, kontinuierliche und semikontinuierliche Kulturen unterscheiden. Die diskontinuierliche oder batch-Kultur (schubweise Kultur) beginnt mit einem kleinen Inokulum in einer im Verhältnis dazu großen Nährlösungsmenge. Die Kultur durchläuft mehrere Wachstumsphasen und stagniert schließlich bzw. beginnt mit einer Inokulation der Algen in frischer Nährlösung. Zur Beschreibung des Wachstumsverlaufs gliedert man die zeitliche Biomassezunahme in fünf Phasen. Die erste nennt man Verzögerungs- oder lag-Phase. Die ergibt sich dadurch, dass sich das Inokulum im frischen Nährmedium an die drastischen Milieuveränderungen in der Regel erst anpassen muss. Darauf folgt die Biomassezunahme in der exponentiellen Wachstumsphase. In ihr findet ungehindertes nichtlimitiertes Wachstum statt. Exponentielles Wachstum tritt nur auf, wenn alle Ressourcen im Sättigungsbereich liegen. Ihr schließt sich eine lange, für die Algenkultivierung typische, lineare Wachstumsphase an. Die Beendigung des linearen Wachstums kann unterschiedliche Ursachen haben: Lichtlimitation durch zunehmende Selbstbeschattung, begrenzte CO2-Versorgung oder Limitation durch einen anderen Nährstoff. Die Stagnationsphase oder Übergangsphase schließt sich an das lineare Wachstum an und reicht bis zur stationären Wachstumsphase. Die stationäre Wachstumsphase ist dadurch gekennzeichnet, das die Wachstumsrate der Sterberate gleicht. In Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen kann sie unterschiedlich lange dauern und schließlich in eine Sterbephase übergehen. Diskontinuierliche Kulturen sind in ihrer technischen Handhabung relativ einfach und für viele Wachstumsuntersuchungen recht gut Grundlagen 11 geeignet. Der Einfluss von Temperatur, pH-Wert, Ionengesamtkonzentration lässt sich so über die Bestimmung der spezifischen Wachstumsrate in der linearen Wachstumsphase charakterisieren. Im Gegensatz zur batch-Kultur wird bei einer kontinuierlichen Kultur ständig Nährlösung im Austausch gegen die Kultursuspension zugeführt. Dieses Kulturverfahren bietet besondere Vorteile zur Analyse des substratlimitierten Wachstums von Mikroorganismen. (Graham und Wilcox, 2000; Kohl und Nicklisch, 1988) 2.2.3 Zusammensetzung der Algenzellwand Die Biosorption stellt eine schnelle Anlagerung von Substanzen an der Oberfläche von biologischen Materialien dar (Kap. 2.3.2). Die Oberfläche von Algen wird von der Zellwand gebildet. In den Zellwandstrukturen der Algen sind die Bindungsstellen lokalisiert. Die Algenzellwand ist ein sehr komplexer Verband einer Vielzahl von Polysacchariden und Proteinen. Einzelne Algen können sich in ihrer Oberflächenstruktur stark voneinander unterscheiden, so daß die folgenden Aussagen nur einen Überblick darstellen. In jedem chemischem Strukturdetail sind die Zellwände der Algen bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Die Zellwand der Algen lässt sich als ein Zweiphasensystem verstehen, welches sich aus einer kristallinen Stützschicht und einer amorphen Matrixschicht zusammensetzt. Die kristalline Stützschicht wird aus neutralen, linearen Polysacchariden gebildet. Die häufigsten Polysaccharide sind α-Cellulose, β1,4-Mannan und β-1,3-Xylan. Die Stützschicht der Cyanophyta besteht von den anderen Algen abweichend aus Murein. Murein ist ein Polysaccharid, das sich abwechselnd aus NAcetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäureresten zusammensetzt. (Kloareg und Quatrano, 1988; Hoek et al., 1995) Die sich der Stützschicht anschließende Matrixschicht stellt den größten Anteil am Aufbau der Zellwand. Die Matrix besteht aus einer Vielzahl von sauren, anionischen Polysacchariden, die eine große technologische Bedeutung besitzen (Kap. 2.2.4). Im Gegensatz zu den Polysacchariden der Stützschicht lassen sich die Matrixpolysaccharide mit heißem Wasser extrahieren. Die wichtigsten Träger der negativen Ladungen sind Carboxyl- und Sulfatgruppen der Monomeren der Matrixpolysaccharide. Die Zusammensetzung einiger wichtiger saurer Polysaccharide wird in Tab. 2–4 gegeben. Besonders erwähnt seien wegen ihrer technologischen Verbreitung die Matrixpolysaccharide (Schleim) der Rotalgen. Der Schleim besteht aus Galactanen (Polymeren von Galactose mit Sulfatestergruppen), von denen Carrageen und Agar die wichtigsten sind (Kloareg und Quatrano, 1988). In neueren Arbeiten haben Ray und Lahaye (1995 a, b; 1996) die Polysaccharide der Zellwand der marinen Grünalge Ulva rigida extrahiert und charakterisiert. Dabei wurden neben 2 Hemicellulosefraktionen, die aus Glucu- 12 Algen ronanen und Glucoxylanen bestanden, sulfatierte Polysaccharide aus Glucose, Xylose, Mannose und Protein sowie Ulvan als Hauptbestandteil in seiner chemischen Struktur bestimmt. Ulvan besteht aus Fraktionen, die verschieden verknüpfte Einheiten aus Rhamnose-3-sulfat, Xylose und Glucuronsäure enthalten. Tab. 2–4: Aufbau und Vorkommen wichtiger saurer Polysaccharide Funktionelle Gruppea Polysaccharid Monomere Vorkommen R-COO- Polyuronideb Galcaturonsäure Glucuronsäure Guluronsäure Mannuronsäure Cyano-, Rhodo-, Heterokonto-, Chlorophyta Alginatc Guluronsäure Mannuronsäure Phaeophyceae Carrageend Galactose-4-sulfat Galactose 3,6-Anhydrogalactose Galactose-2,6-disulfat Rhodophyta Agard Galactose 3,6-Anhydrogalactose jeder 10. Baustein -SO3H-Gruppe Rhodophyta Fucoidane Fucose-4-sulfat Desoxygalactose Phaeophyceae Ulvanf Rhamnose-3-sulfat Glucuronsäure Xylose Chlorophyceae R-O-SO3- R-COOR-O-SO3a Kloareg und Quatrano, 1988 Becker et al., 1998; Nicolaus et al., 1999; Paulsen et al., 1998 c Usov und Klochkova, 1994; Dietrich et al., 1995 d Stevenson und Furneaux, 1991; Burdin und Bird, 1994; Liao et al., 1996 e Nishida et al., 1990; Honya et al., 1999 f Ray und Lahaye, 1995 a, b; 1996 b Die Struktur einiger Polysaccharide mit Carboxyl- (Polyuronide) und Sulfatgruppen (Fucoidan) im Molekül sind in der Abb. 2–1 dargestellt. Grundlagen 13 Polymannuronsäure Polyguluronsäure Fucoidan Abb. 2–1: 2.2.4 Struktur ausgewählter saurer Polysaccharide (Kloareg und Quatrano, 1988) Technologische Bedeutung von Algen Eine Vielzahl von Algeninhaltsstoffen werden in verschiedenen Industriezweigen der Lebensmittelindustrie, Pharmazie und Biotechnologie eingesetzt. Im folgenden sollen auf die Nutzung der wichtigsten Inhaltsstoffe ein wenig näher eingegangen werden. Proteine, die hohe Anteile an essentiellen Aminosäuren enthalten, finden in der Lebensmittelindustrie für den direkten Verzehr als auch in der Viehzucht als Futterergänzungsmittel Verwendung (Graham und Wilcox, 2000; Anusuya und Venkataraman, 1984). Lipide (Phospholipide, Glucolipide) und hochgesättigte C16-C22 Fettsäuren werden von einigen Mikroalgen in großen Mengen gebildet und dienen der Behandlung von Hyperlipidämien und Artherosklerose (Dembitzky et al., 1990; Graham und Wilcox, 2000). Patterson et al. (1994) beschreiben eine aktive Hemmung von Viren (Herpes, HIV) durch Sulfolipide einiger Cyanophyta. 14 Verfahren zur Schwermetallentfernung Carotinoide und Phycobiliproteine, wie α- und β-Carotin, Echinenon, Canthaxanthin und Astaxanthin, werden überwiegend in der Lebensmittelindustrie als lipophile Farbstoffe eingesetzt (Borowitzka, 1986). Aus technologischer Sicht am Bedeutesten sind die Polysaccharide und vor allem die Exopolysaccharide der Algenzellwand. Die Exopolysaccharide der Rhodophyta (Carrageen, Agar) und Phaeophyceae (Alginat) finden als Geliermittel und Dispersionskolloide in der Lebensmittel-, Textil-, Papier-, Farb-, Öl- und Detergentienindustrie, sowie in der Pharmazie und Medizin große Verwendung (Kapraun, 1999; White et al., 1999; Graham und Wilcox, 2000). Auch als Antitumorstoffe, Antibiotika und Virus hemmende Substanzen werden Algenpolysaccharide in der Medizin eingesetzt (Itoh et al., 1993; Patterson et al., 1994; Santos et al., 1999; Graham und Wilcox, 2000). Eine große Bedeutung in der Zukunft wird ein intensives Screening nach weiteren vor allem medizinisch wirksamen Substanzen aus Algen einnehmen, da hier durch die Artenvielfalt natürliche Potentiale vorhanden sind, die heute erst zu einem Bruchteil erforscht und genutzt sind. 2.3 Verfahren zur Schwermetallentfernung 2.3.1 Konventionelle Verfahren Zur Herabsetzung von Schwermetallemissionen aus Abwasserströmen und der notwendigen Einhaltung der vorgeschriebenen Grenzwerte (Tab. 2–2) werden folgende Verfahren eingesetzt: Fällung, Ionenaustausch, Elektrolyse, Adsorption (Kap. 2.3.1.1) und Membrantrennverfahren. Bei hohen Schwermetallkonzentrationen kommen in erster Linie Fällung und Elektrolyse zum Einsatz. Bei der Fällung werden die Metalle mit Hilfe geeigneter Fällungsmittel in schwerlösliche Metallverbindungen (Hydroxide, Carbonate oder Sufide) überführt. Diese Verbindungen können vom Wasser durch Filtration getrennt werden. Der entstehende Rückstand ist als Sondermüll zu deponieren. Bei der Elektrolyse wird das elektrochemische Verhalten der Metalle genutzt, um das Abwasser zu reinigen. Die an der Elektrode abgeschiedenen Metalle können leicht wiederverwendet werden. Der Nachteil dieser beiden Verfahren liegt in der unzureichenden Wirksamkeit bzw. zu hoher Kosten bei niedrigen Metallkonzentrationen in der Lösung. Zur Entfernung relativ niedriger Schwermetallkonzentrationen, vorzugsweise unter 500 mg/L, sind Adsorptions-, Membran- und Ionenaustauschtechnologien besonders geeignet. Die Adsorptionsverfahren werden nur noch vereinzelt angewandt, da eine Regeneration des Adsorbens oft nur bedingt möglich ist. Die wichtigsten Adsorbenzien stel- Grundlagen 15 len Aktivkohle, Aluminiumstäube, keramische und pflanzliche Materialien (Cellulose, Xanthate) dar. Zu den Membranverfahren gehören Elektrodialyse und Umkehrosmose. Bei der Elektrodialyse trennen abwechselnd parallel zueinander liegende Kationen- und Anionenaustauschermembranen die konzentrierte Schwermetalllösung von dem durch Anlegen eines elektrischen Feldes schwermetallverarmten Wasser. Bei der Umkehrosmose erfolgt ebenfalls eine Aufkonzentrierung der Schwermetalle durch Membranen. Die treibende Kraft ist ein hoher hydrostatischer Druck anstelle eines elektrischen Feldes. Ionenaustauscher besitzen eine breite Anwendung in der Abwasserreinigung und dienen vor allem zur Reinigung der Abwässer im Bereich der Grenzwerte. Die Schwermetalle werden an einem Ionenaustauschermaterial angelagert und nach Beladung durch geeignete Desorptionsverfahren (Säuren, Salze) wieder entfernt, so dass nach erfolgter Desorption hochkonzentrierte Schwermetalllösungen vorliegen. Die aufkonzentrierte Lösung kann beispielsweise elektrolytisch gereinigt werden. Im Kapitel 2.3.1.2 werden weiterführende Details zum Ionenaustausch gegeben. (Kümmel und Worch, 1990; Brooks, 1991; Wilmoth et al., 1991; Dorfner, 1991; Berends und Hartmeier, 1992; Röhricht et al., 1993) Im Allgemeinen gilt, je niedriger die Konzentration eines gelösten Metalls ist, umso höher sind Aufwand und Kosten eines technischen Verfahrens für dessen Rückhaltung. Aus diesem Grund wird nach alternativen Verfahren zur Metallentfernung aus Abwässern gesucht. In den letzten zehn Jahren haben dabei Mikroorganismen eine immer wichtigere Rolle in der Suche nach neuen Ansätzen gespielt. Der natürliche Prozess der Biosorption wird bei diesen Anwendungen besonders beachtet. Die Biosorption stellt ein Zusammenwirken einer Reihe von chemischen Reaktionen dar, wobei Adsorptions- und Ionenaustauschprozesse eine besondere Bedeutung besitzen (Kap. 2.3.2). Im folgenden werden deshalb einige wichtige Grundlagen dieser beiden Prozesse näher erläutert. (Volesky, 1990; Veglio und Beolchini, 1997; Brauckmann, 1997; Wase und Forster, 1997; Wong und Tam, 1998; Atkinson et al., 1998; Bailey et al., 1999) 2.3.1.1 Grundlagen der Adsorption Die Anlagerung von Teilchen an Oberflächen wird als Adsorption bezeichnet. Die Teilchen können Atome, Moleküle oder Ionen sein. Ursache dieser Anlagerung sind Wechselwirkungen der Oberflächenzentren des Adsorbens mit den Inhaltstoffen umgebender Flüssigkeiten und Gase. Bei der Betrachtung der Ursachen der Anlagerung unterscheidet man zwischen der rein physikalischen Adsorption und der Chemisorption. Dabei ist die physikalische Adsorption hauptsächlich auf einer Bindung des Adsorptivs an das Adsorbens durch zwischenmoleku- 16 Verfahren zur Schwermetallentfernung lare Kräfte, Van-der-Waalsche Kräfte (Dipolkräfte, Dispersonskräfte, Induktionskräfte) zurückzuführen. Der energetisch stabilere Zustand wird bei der Chemisorption durch chemische Bindungskräfte der funktionellen Gruppen der Adsorberoberfläche analog einer chemischen Bindung durch Elektronentransfer oder durch gemeinsam genutzte Elektronen erreicht. Eine genaue Einteilung einer real auftretenden Adsorption ist nicht immer möglich, da beide Phänomene eine Rolle spielen können. Die Lage des Gleichgewichtes einer chemischen Reaktion bei konstantem Druck und Temperatur wird durch die Konzentration seiner Ausgangsstoffe bestimmt. Eine ähnliche Abhängigkeit liegt auch zwischen Adsorbens- und Adsorptivmenge vor. Für jede Adsorptivkonzentration stellt sich nach hinreichend langer Zeit bei konstanter Adsorbensmenge, Druck und Temperatur, ein bestimmtes Verteilungsgleichgewicht ein. Der zeitliche Verlauf des Adsorptionsprozesses wird als Kinetik der Adsorption bezeichnet. Sie beschreibt den Adsorptionsvorgang bis zum Erreichen des Gleichgewichtszustandes. Nach Einstellung des Gleichgewichtes spricht man bei der Beladung des Adsorbens von Gleichgewichtsbeladung (qeq) und der Konzentration des Adsorptivs in der Lösung von Gleichgewichtskonzentration (ceq). Die Gleichgewichtsdaten für verschiedene Adsorbens-AdsorptivVerhältnisse bei konstanter Temperatur lassen sich mit Hilfe von Modellen zur Beschreibung der Adsorptionisothermen auswerten. Diese dienen der Einschätzung und Vergleichbarkeit der Adsorption und bilden die Grundlage für die Auslegung technischer Prozesse. Die bekanntesten Modelle zur Beschreibung von Adsorptionsgleichgewichten sind die nach Langmuir (Gl. 2–1) und Freundlich (Gl. 2–3). (Kümmel und Worch, 1990; Berends und Hartmeier, 1992; Atkins, 1998) Das Langmuirsche Adsorptionsmodell leitet sich aus theoretischen Überlegungen mit folgenden Annahmen ab: maximale monomolekulare Bedeckung, gleichwertige Adsorptionsstellen und Adsorption/Desorption sind reversibel. Gl. 2–1 beschreibt eine Adsorptionsisotherme nach Langmuir: Gl. 2–1: qeq = qmax b ceq / (1 + b ceq) In Gl. 2-1 ist qmax die maximale Beladungskapazität, qeq die Menge an Metall, welche aus einer gegebenen Lösung aufgenommen wurde, und ceq ist die Gleichgewichtskonzentration des Metalls in Lösung. Die Langmuirkonstante b stellt eine Gleichgewichtskonstante dar, die die Affinität des Metalls zur Algenoberfläche beschreibt. Durch eine einfache Linearisierung ist es möglich die Konstante b und die maximale Metalladsorption qmax zu bestimmen: Gl. 2–2: ceq / qeq = ceq / qmax + 1 / (qmax b) 17 Grundlagen Durch Auftragen von ceq/qeq über ceq ist qmax aus dem Anstieg der Geraden berechenbar und b aus dem Wert des Schnittpunkts mit der y–Achse. (Kümmel und Worch, 1990; Atkins, 1998) Das Adsorptionsmodell nach Freundlich wird in der hier beschriebenen Form ebenfalls für Einstoffisothermen angewendet (Gl. 2–3). Dem Modell liegt ein empirischer Ansatz zugrunde, welcher einen exponentiellen Verlauf der Gleichgewichtsbeladung in Abhängigkeit von der Gleichgewichtskonzentration beschreibt. Gl. 2–3: qeq = k ceq 1/a. Die linearisierte Form der Gl. 2–3 lautet: Gl. 2–4: log qeq = log k + a log ceq. Wird qeq über ceq im doppeltlogarithmischen Maßstab aufgetragen, so kann die Freundlichkonstante k als y-Abschnitt bei ceq = 1 und der Freundlichexponent a aus dem Anstieg der Geraden ermittelt werden. Die Größe von k bzw. a drückt die Adsorbierbarkeit eines Stoffes am entsprechenden Adsorber aus. (Kümmel und Worch, 1990; Atkins, 1998) 2.3.1.2 Grundlagen von Ionenaustauschern Als Ionenaustauscher finden in der Regel Polymerprodukte Verwendung, die in der Lage sind, aus dem Wasser positiv und negativ geladene Ionen zu binden. Die Eigenschaften der Ionenaustauscher beruhen auf drei Faktoren: den Grundkörper für das Gerüst (Matrix), den Brückenbildnern zur Quervernetzung (Unlöslichkeit in Wasser) und den funktionellen Gruppen (aktiver Teil). Als Grundkörper dienen meist Polymerisationsprodukte (z.B. Polystyrol, Polyacrylat), aber auch Naturstoffe (Lignin, Cellulose, Harze). Als funktionelle Gruppen werden in erster Linie folgende verwendet: • -SO3- stark saure Kationenaustauscher • -COO- schwach saure Kationenaustauscher • -N(CH2COO-)2 Chelatharze • -NR3+ stark basische Anionenaustauscher (R: -CH3, -CH2CH2OH u.a.) • -N(CH3)2H+, -NH2+, -NH3+ schwach basische Anionenaustauscher. Die Aufnahme von Metallionen erfolgt meistens im Austausch gegen Na+ - oder H+ - Ionen und bei Anionen gegen OH- oder Cl- - Ionen. Eine allgemeine Reaktionsgleichung für einen Ionenaustausch lautet : R-I + M± R-M + I± 18 Verfahren zur Schwermetallentfernung R ist dabei der unlösliche Anteil mit dem beladenen, auszutauschenden Ion I. M ist das geladene Ion in der Lösung (z.B. Metallion), welches an den Ionenaustauscher gebunden werden soll. Die aufgenommenen Ionen werden meist durch Säure, seltener durch Lauge und Salze, eluiert. Für die Entfernung von Metallionen kommen in der Regel nur selektive, schwach saure Ionenaustauscher und Chelatharze zum Einsatz, die gewöhnlich in der Natriumform vorliegen. (Dorfner, 1991; Röhricht et al., 1993) 2.3.2 Biosorption Die Beobachtung einer Anreicherung von Schwermetallen im Klärschlamm führte zu ersten Untersuchungen dieses Phänomens. Es wurde entdeckt, dass Mikroorganismen für diese Metallbindung verantwortlich sind (Volesky, 1990; Berends und Hartmeier, 1992). Dabei kann zwischen zwei verschiedenen Mechanismen unterschieden werden (Volesky, 1990; Berends und Hartmeier, 1992; Fehrmann et al., 1993; Wase und Forster, 1997): a) Biosorption • Überbegriff für eine Reihe verschiedener chemischer Reaktionen, die zur passiven Anlagerung (Sorption) von Schwermetallen an biologischen Molekülen führen (Komplexierung, Chelatbildung, Ionenaustausch, Adsorption und Mikropräzipation) • reversible, schnelle Reaktion der Metallionen mit den funktionellen Gruppen der Zellwandpolymere lebender oder toter Organismen b) Bioakkumulation • aktive (langsame) Aufnahme der Metalle durch lebende Organismen, die dabei Energie verbrauchen Geisweid und Urbach (1982) und Fehrmann und Pohl (1993) berichten, dass ungefähr 90% der insgesamt durch Algenbiomasse aufgenommenen Cadmiummenge in den ersten fünf bis zehn Minuten durch Biosorption angelagert wird und nur 10% des Cadmiums in den folgenden Stunden und Tagen durch Bioakkumulation in den Organismus gelangt. Mikroorganismen und pflanzliches und tierisches Material, wie z.B. Sägespäne und Chitin, können Biosorbenzien mit großer Bindungskapazität für verschiedene Metalle darstellen, wobei auch tote Zellmasse sehr wirksam ist (Holan und Volesky, 1995). In der Mehrzahl wurden die Untersuchungen in den letzten Jahren an toter Biomasse durchgeführt (Greene und Darnall, 1990; Aksu und Kutsal, 1991; Fehrmann und Pohl, 1993; Holan et al., 1993; Holan und Volesky, 1994; Winter et al., 1994; Volesky und Holan, 1995). Nur wenige Artikel beschäftigen sich mit der Untersuchung an lebender Biomasse (Geisweid und Urbach, 1982; Seferlis Grundlagen 19 und Haritonidis, 1995). Der Einsatz toter Biomasse ist wirtschaftlich besonders interessant, da die Biomaterialien wie synthetische Adsorbenzien oder Ionenaustauscher als Reaktorfüllmaterial eingesetzt und mehrfach regeneriert werden können (Winter et al., 1994; Bakkaloglu et al., 1998; Matheickal und Yu, 1996; Winter et al., 1994; Volesky und Holan, 1995). Volesky und Holan (1995) und Veglio und Beolchini (1997) zeigen in Übersichtsartikeln über die Entfernung von Metallen durch Biosorption, dass Algen, Bakterien, Hefen und Pilze sich als gute Schwermetalladsorber erweisen. In einer Übersichtstabelle werden die Metalle und die jeweiligen als Biosorbenzien geeigneten Organismen aufgelistet. Die untersuchten Metalle umfassen Chrom, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink, Cadmium, Silber, Gold, Blei, Thorium und Uran. Der Wissensstand zur Biosorption der zu untersuchenden Metalle ist in Tab. 2–5 für ausgewählte Biosorbenzien beispielhaft dargestellt. Die Zusammenstellung verdeutlicht die hohe Aufnahmefähigkeit verschiedener Biosorbenzien für Metalle, wobei zwischen den einzelnen Materialien erhebliche Unterschiede bestehen. Besonders marine Makroalgen haben eine große Bedeutung in der Forschung und Entwicklung von neuen Biosorbenzien, weil sie zum Teil höhere Kapazitäten als klassische Ionenaustauscher aufweisen und in unbegrenzter Menge in den Ozeanen vorkommen (Leusch et al., 1995; Leusch et al., 1996; Volesky und Holan, 1995, Garnham, 1997; Yu et al., 1999, Matheickal und Yu, 1999). Die Eignung von Mikroalgen als Biosorbenzien ist dagegen wenig untersucht, obwohl sie eine große biotechnologische Bedeutung als Produzenten von Naturstoffen besitzen und ebenfalls gute Biosorptionseigenschaften zeigen (Fehrmann und Pohl, 1993; Wong und Tam, 1998; Matsunaga et al., 1999; Bunke et al., 1999). Fehrmann und Pohl (1993) zeigten das vor allem Blaualgen in den Untersuchungen hervorragende Biosorptionseigenschaften besitzen. Die Abfallbiomassen der Mikroalgen, beispielsweise aus einer Naturstoffproduktion, sind äußerst kostengünstig (Fehrmann und Pohl, 1993; Sandau et al., 1996). 20 Verfahren zur Schwermetallentfernung Tab. 2–5: Bindungskapazität ausgewählter Biosorbenzien Biomasse 1,73 Holan et al., 1993 Alge 1,18 Yu et al., 1999 Hefe 0,53 Mattuschka et al., 1993 Pilz 0,50 Holan und Volesky, 1995 Alge 0,36 Winter et al., 1994 Rhizopus arrhizus Pilz 0,22 Volesky, 1992 Bacillus subtillis Bakterie 2,39 Brierley und Brierley, 1993 Arthrobacter spezies Bakterie 2,33 Veglio et al., 1997 Saragassun fluitans Alge 1,86 Leusch et al., 1996 Durvillaea potatorum Alge 1,30 Matheickal und Yu, 1999 Candida tropicalis Hefe 1,26 Mattuschka et al., 1993 Chlorella vulgaris Alge 0,67 Aksu et al., 1992 Saragassun fluitans Alge 1,28 Leusch et al., 1996 Fucus vesiculosus Alge 0,68 Holan und Volesky, 1994 AscophyIlum nodosum Alge 0,51 Holan und Volesky, 1994 Candida tropicalis Hefe 0,34 Mattuschka et al., 1993 Rhizopus arrhizus Pilz 0,31 Fourest und Roux, 1992 Arthrobacter spezies Bakterie 0,22 Veglio et al., 1997 Fucus vesiculosus Alge 1,79 Holan und Volesky, 1994 Saragassun fluitans Alge 1,78 Leusch et al., 1996 Durvillaea potatorum Alge 1,55 Matheickal und Yu, 1999 Rhizopus nigricans Pilz 0,80 Holan und Volesky, 1995 Arthrobacter spezies Bakterie 0,63 Veglio et al., 1997 Streptomyces longwoodensis Pilz 0,48 Mattuschka et al., 1993 Saragassun fluitans Alge 1,16 Leusch et al., 1996 Candida tropicalis Hefe 0,46 Mattuschka et al., 1993 Ascophyllum nodosum Alge 0,39 Bakkaloglu et al., 1998 Rhizopus arrhizus Pilz 0,31 Tobin et al., 1984 Pseudomonas syringae Bakterie 0,12 Cabral, 1992 Bacillus spezies Zn Alge Ectocarpus silicolosus Pb Ascophyllum nodosum Penicillium chrysogenum Ni Referenz Candida tropicalis Cu Beladung (mmol/g)* Durvillaea potatorum Cd Einordnung Bakterie 0,05 Cotoras et al., 1993 * höchster, beschriebener Beladungswert Grundlagen 2.3.2.1 21 Mechanismus der Biosorption Das Biosorptionsmaterial kann als eine Art “biologischer Ionenaustauscher“ betrachtet werden. Die Biosorption stellt eine temperaturabhängige Gleichgewichtsreaktion zwischen der Oberfläche der Biomasse und des Metalls in Lösung dar. Diese Adsorptionsvorgänge werden unter isothermen Bedingungen durch die Adsorptionsmodelle von Langmuir und Freundlich beschrieben. Die Biosorption der Schwermetalle wird, wie Christ et al. (1988, 1990, 1992, 1994, 1999) und Volesky und Holan (1995) zeigten, quantitativ am besten durch die Langmuir-Adsorptionsisotherme beschrieben. Nur für kleine Gleichgewichtskonzentrationen in der Lösung gilt die Freundlich-Adsorptionsisotherme, da Freundlich eine max. Beladung der Oberfläche des Adsorbens in seinem Modell nicht vorsieht. Christ et al. (1988, 1990, 1992, 1994, 1999) untersuchten die Wechselwirkung von Metallen und Protonen mit Algen und konnten dadurch einige chemische Vorgänge bei der Biosorption aufklären. Sie identifizierten verschiedene funktionelle Gruppen, wie negativ geladene Carboxyl- und Sulfatgruppen, aber auch OH-, SH- und NH-Gruppen der Algenzellwand als Bindungsstellen für die Metalle. Ein Ionenaustauschprozess in Abhängigkeit vom pH-Wert konnte als wichtiger Mechanismus der Biosorption an Vaucheria gezeigt werden. Desweiteren waren ungeladene Aminogruppen besonders bei der Biosorption von Kupfer an Vaucheria beteiligt. Greene und Darnall (1990), zeigten, dass sich der optimale pH-Bereich für die Adsorptionsuntersuchungen von Cadmium und Blei an Chlorella vulgaris von pH 5 bis 7 erstreckt. Gardea-Torresdey et al. (1990) beschreiben in einer Studie an fünf Algenarten ebenfalls die Bedeutung des Caboxylatanions für die Biosorption von Kupfer und Aluminium. Untersuchungen zur Entfernung von Cadmium und Blei mit der Alge Saragassum fluitans (Fourest und Volesky, 1996) und Kupfer, Strontium, Cadmium und Blei mit der Pflanze Datura innoxia (Lin und Rayson, 1998; Drake et al., 1996) aus wässrigen Lösungen bestätigten die Bedeutung von anionischen, funktionellen Gruppen der Zellwandpolymere (Tab. 2–4) für die Biosorption. Fehrmann und Pohl (1993) bestimmten für eine Vielzahl von Algen den Carboxylund Sulfatgruppengehalt und entdeckten einen besonders hohen Gehalt bei den Vertretern der Braunalgen. Die in vielen Arbeiten beschriebene hohen Bindungskapazität von Braunalgen wird durch diese Untersuchungen verständlich (Volesky und Holan, 1995; Matheickal und Yu, 1999; Yu et al., 1999). Nach Erkennung der Bedeutung von anionischen funktionellen Gruppen auf der Oberfläche für die Biosorption der Metalle wurde versucht, zusätzliche ionenaktive Gruppen in die Zell- 22 Verfahren zur Schwermetallentfernung wandpolymere einzubauen (Xie et al., 1996; Meisch und Gauer, 1998; Marshall et al., 1999; Kraemer und Meisch, 1999). In einem kürzlich erschienenen Übersichtsreferat berichten Meisch und Gauer (1998) von der Derivatisierung von Holz und Krabbenschalen zur Erzeugung von Ionenaustauschern für die Entfernung von Blei, Cadmium, Zink, Kupfer, Nickel sowie Kalzium, Eisen und Chrom aus wässrigen Lösungen. In die Biopolymere Cellulose, Hemicellulosen, Lignin und Chitin wurden Phosphorsäure-, Carboxyl-, Ethylendiamino und Iminodiacetatgruppen mit großem Erfolg eingeführt. Die Modifizierung führte sowohl zur Erhöhung der Kapazität als auch der Selektivität gegenüber einzelnen Metallen. 2.3.2.2 Möglichkeiten für den industriellen Einsatz Die Biosorbenzien können für die Verringerung der Schwermetallkonzentrationen in Ab-, Oberflächen- und Grundwässern eingesetzt werden. Es ist eine Reinigung der Wässer bis unter die für Trinkwasser geforderten Grenzwerte möglich (Berends und Hartmeier, 1992). Das biologische Ausgangsmaterial muss durch Immobilisierung so modifiziert werden, dass es wasserunlöslich wird und ein unerwünschter Austrag aus dem Reaktor nicht mehr möglich ist. Außerdem können strömungstechnische Probleme durch die bei der Immobilisierung weitgehend einstellbare Partikelform, -größe und -konsistenz beherrschbar gemacht werden (Hartmeier, 1986; Bunke et al., 1999). Es gibt schon Patente über den Einsatz von toter Biomasse, wie z.B. den AMT-BIOCLAIM-Prozeß, bei dem ein granuliertes Bacillus-Präparat eingesetzt wird (Brierley et al., 1986; Brierley, 1990). Desweiteren ist in den USA ein Biosorptionsmittel aus Algen erhältlich (AlgaSorbTM), das aus immobilisierten Algenzellen in Silicon besteht (Greene et al., 1987). Die Eisu GmbH in Wolfen produziert seit drei Jahren ein preiswertes Biosorbens aus modifizierten Holzabfällen, welches hervorragende Biosorptionseigenschaften besitzt (Kraemer et al., 2000). Die Vorteile eines Biosorptionsverfahrens liegen zusammenfassend gegenüber den klassischen Verfahren in folgenden Punkten: • günstige Kostensituation bei Biomaterialien • hohe Schwermetallbindungskapazität • Rückgewinnbarkeit der Metalle. Problemstellung und Lösungsansätze 3 23 Problemstellung und Lösungsansätze Im Sonderforschungsbereich (Sfb) 193 "Biologische Behandlung industrieller und gewerblicher Abwässer" der Technischen Universität Berlin wurden seit 1997 in zwei Teilprojekten (TP) Grundlagenkenntnisse über die Ausnutzung des natürlichen Prozesses der Biosorption von Schwermetallen an Algen für die Abwasserreinigung erarbeitet. Im Projekt F standen vor allem Mikroalgen im Mittelpunkt, die von ihrem biotechnologischem Potential vielversprechend sind. Die verwendeten Algen wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. R. Buchholz am Institut für Biotechnologie der TU Berlin (TP F3) taxonomisch bestimmt und kultiviert. Die Ziele des TP F2, in dessen Rahmen die vorliegende Arbeit angefertigt wurde, gliedern sich in folgende Schwerpunkte auf: • Erarbeitung einer effektiven Analytik der zu untersuchenden Schwermetalle für den Projektbereich F • Entwicklung einer Methode für ein effizientes Screening einer Vielzahl von Algen zur Erkennung der für die Abwasserreinigung geeignetsten Spezies • Untersuchungen der Biosorptionseigenschaften ausgewählter Spezies • Charakterisierung des Mechanismus der Biosorption und Möglichkeiten zur Beeinflussung der Bindungsspezifität und -kapazität durch chemische Modifizierung der Biosorbenzien. Im TP F3 sollten diese Ergebnisse auf ein anwendungsorientiertes Verfahren zur Abwasserreinigung übertragen werden. Die Vielzahl von zu analysierenden Schwermetallproben aus beiden Projekten erforderte eine sehr effektive Analytik. Der Einsatz der GF-AAS mit entsprechender Automatisierung sollte zeigen, ob sich diese Methode als robust und für die Routineanalytik geeignet erweisen wird, um die Probenmenge zu bewältigen. Das Ziel der ersten Projektphase besteht in der Etablierung einer Screeningmethode. Die Screeningmethode leitet sich aus Arbeiten mit der Chlorophyceae Chlorella vulgaris ab. Die Alge soll als Standard für die Screeninguntersuchungen eingesetzt werden. Danach sollten die Biosorptionseigenschaften der leistungsfähigsten Algen im Screening weiter untersucht werden. Durch die Aufnahme von Adsorptionsisothermen zur Bestimmung der Kapazitäten, Untersuchungen zur Selektivität, der Einfluss von Faktoren wie pH und Erdalka- 24 Problemstellung und Lösungsansätze lisalze und Desorptionsuntersuchungen sollten diese weiter charakterisiert werden, um schließlich mit einem realem Abwasser überprüft zu werden. In Hinblick auf eine Anwendung der Algen als Schwermetalladsorbens, speziell für die Beeinflussung der Biosorptionseigenschaften der Algen, ist die Kenntnis der chemischen Vorgänge während der Biosorption der Metalle sehr wichtig. Die Charakterisierung der Bindungsstellen der Metalle an der Oberfläche der Algen ist von besonderer Bedeutung. Eine gezielte Blockierung von funktionellen Gruppen der Algenzellwand sollte zeigen, ob diese Gruppen wirklich entscheidend an der Biosorption beteiligt sind. Mittels Elementaranalyse der Algen, Extraktion von Zellwandbestandteilen und Analyse der Zuckermonomeren der Zellwandpolysaccharide ausgesuchter Algen sollten die Bindungstellen weiter charakterisiert werden. Schließlich werden spektroskopische Verfahren wie FT-IR Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) in Kombination mit einer Röntgenmikroanalyse eingesetzt, um wichtige Erkenntnisse zur Zusammensetzung und Struktur der Algenoberfläche zu gewinnen. Zur weiteren Charakterisierung der Biosorbenzien sollten auch Untersuchungen zur spezifischen Oberfläche durchgeführt werden. Der Schwerpunkt der letzten Projektphase sollten Untersuchungen zur Beeinflussung der Bindungsspezifität und –kapazität durch Einbau zusätzlicher funktioneller Gruppen in die Zellwandpolysaccharide bilden. Dazu werden Verfahren zur Einführung von Carboxyl- und Phosphatgruppen in die Biopolymere ausgewählter Algen auf ihre Anwendbarkeit überprüft. 25 Material und Methoden 4 Material und Methoden 4.1 Materialien Alle verwendeten Chemikalien, sonstigen Materialien und Geräte sind detailliert zu den einzelnen Methoden (Kap. 4.3 - 4.6) im Anhang dargestellt. Auf spezielle Materialien soll in den folgenden zwei Kapiteln näher eingegangen werden 4.1.1 Algenbiomasse Die verwendeten Algenarten sind aus der Stammsammlung für Algen in Göttingen (SAG) und der Stammsammlung des Instituts für Biotechnology der TU Berlin (ISA) entnommen. Die Algen wurden im Institut für Biotechnologie kultiviert. Zu Details der Kultivierung sei auf die Dissertation von Wilke (2001) verwiesen. Eine Ausnahme stellt die Alge Vaucheria dichotoma dar, die von Dr. Henschel direkt in der Ostsee geerntet und dem Projekt zur Verfügung gestellt wurde. In Tab. 4–1 sind die untersuchten Algen aufgelistet. Tab. 4–1: Untersuchte Algen Algenklasse Algenart Herkunft Bacillariophyceae Phaeodactylum tricornutum SAG 1090-6 Bangiophyceae Porphyridium purpureum SAG 112.79 Chlorophyceae Acinastrum hantzschii ISA Ankistodesmus densus SAG 202-1 Chlorella kessleri SAG 211-11g Chlorella salina SAG 8.86 Chlorella spezies ISA Chlorella vulgaris SAG 211-11b Dunaliella bioculata SAG 19-4 Dunaliella salina SAG 184.80 Gloeotilopsis planctonica SAG 29.93 Granulocystis verrucosa SAG 56.81 26 Materialien Algenklasse Algenart Herkunft Chlorophyceae Koliella spiculiformis ISA Raphidonema spiculiforme ISA Tetraselmis spezies ISA Anabaena cylindrica SAG 1403-2 Anabena inaequealis SAG 1403-10 Arthronema africanum ISA Gloeotrichia longicauda SAG 32.84 Lyngbia taylorii ISA Microcystis aeroginosa SAG 14.85 Microcystis spezies ISA Nostoc parmeloides ISA Phormidium spezies ISA Scytonema hofmani ISA Spirulina laxissima SAG B 256.80 Spirulina maxima SAG B 84.79 Spirulina platensis SAG 257.80 Synechococcus spezies ISA Eustigmatophyceae Eustigmatos magnus SAG 36.89 Xanthophyceae Vaucheria dichotomaa Ostsee, Finnland Cyanophyceae a Die Alge wurde von Dr. D. Henschel (Universität Bremen) im Rahmen eines einmonatigen Forschungsaufenthalt im Sfb 193 bereitgestellt. 4.1.2 Vergleichssorbenzien Zur Einordnung der Biosorptionsleistungen der Algen wurden andere Sorbenzien unter gleichen Bedingungen untersucht. Die verwendeten Sorbenzien sind in Tab. 4–2 aufgeführt. Material und Methoden Tab. 4–2: 27 Vergleichssorbenzien Sorbens Spezifikation, Hersteller Carbion Ionenaustauscher; Eisu GmbH, Wolfen Chitosan Polysaccharid; Prof. Buchholz, Institut für Biotechnologie, TU Berlin DW 22 Ionenaustauscher; Mallinckrodt Baker, Griesheim Glucaferm Abfallbiomasse (Saccharomyces cerevisiae, Hefe); Prof. Fleischer, Fermentation, Institut für Lebensmitteltechnologie, TU-Berlin Klo-235 Polysaccharid; Prof. Buchholz, Fermentation, Institut für Biotechnologie, TU Berlin 4.2 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren 4.2.1 Atomabsorptionsspektroskopie Die Atomabsorptionsspektrometrie ist die Messung einer Absorption von optischer Strahlung durch Atome im Gaszustand. Bei der AAS gilt das Lambert-Beerschen Gesetz (Gl. 4–1), daß heißt, es besteht eine lineare Beziehung zwischen der Extinktion (E), der durchstrahlten Schichtdicke (d) und der Konzentration (c) oder Anzahl der Atomen in der Atomisierungseinrichtung. Gl. 4–1: E = ε * c * d (ε - Absorptionskoeffizient) Die wesentlichen Komponenten eines Atomabsorptionsspektrometers sind • eine Strahlungsquelle, die das Spektrum des zu bestimmenden Elements aussendet, • eine Atomisierungseinrichtung, • ein Monochromator zur spektralen Zerlegung der Strahlung mit einem Austrittsspalt, der die Resonanzlinie aussondert, • ein Detektor (Photomultiplier) der Strahlungsintensität, gefolgt von einem Verstärker und einem Anzeigegerät für die Meßwertausgabe. Als Strahlungsquelle werden Hohlkathodenlampen (HKL) verwendet. Eine Hohlkathodenlampe besteht aus einem mit Neon oder Argon unter einem Druck von wenigen Hektopascal gefüllten Glaszylinder, in dem eine Kathode und eine Anode eingeschmolzen sind. Die Kathode hat die Form eines Hohlzylinders und ist aus dem zu analysierendem Element gefertigt. Wird eine Spannung von einigen hundert Volt zwischen den Elektroden angelegt, so entsteht 28 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren eine Glimmentladung, die die Gasmoleküle ionisiert. Die positven Gasionen schlagen aus der Kathode Metallatome heraus und regen diese zur Strahlung ihres spezifischen Emmissionsspektrums an. Als Atomisierungseinheiten werden bei der AAS die Flammen- oder die Graphitrohrofentechnik verwendet. In der vorliegenden Arbeit wird ausschließlich die Graphitrohrofentechnik angewandt und hier näher beschrieben. Ein Graphitrohrofen besteht aus einem Graphitrohr, das von zwei gekühlten Graphitkontakten gehalten wird, die gleichzeitig der Stromzufuhr dienen. Durch Anlegen einer Spannung von z.B. 8 V und einer Stromstärke von 400 A lässt sich ein solches Graphitrohr durch Widerstandsheizung in wenigen Sekunden auf Temperaturen von etwa 3000 °C bringen. Eine Schutzgasströmung aus Argon verhindert das Verbrennen des Rohrs bei höheren Temperaturen. Es gibt drei verschiedene Ausführungen von Graphitrohren: zum einen normale Rohre aus Graphit, desweiteren pyrolytisch beschichtete Graphitrohre und Graphitrohre mit einer Plattform (“L`vov-Plattform“). Welz und Sperling (1997) und Manning und Slavin (1978) beschreiben eine bis zu 70 %ige Empfindlichkeitssteigerung bei pyrolytisch beschichteten Graphitrohren, die durch Pyrolyse von Kohlenwasserstoffen, z.B. Methan bei etwa 2000°C im Graphitrohr, hergestellt werden. Die Empfindlichkeitssteigerung lässt sich mit einem Verschließen von Rissen oder Fehlstellen im Graphitrohr erklären. Die “L`vov-Plattform“ ermöglicht eine Atomisierung der Probe in eine thermisch stabilisierte Atmosphäre hinein, da diese Plattform nicht durch Widerstandsheizung sondern durch Strahlung von der Rohrwand aufgeheizt wird. Slavin et al. (1981) fanden damit weniger Störungen durch Gasinterferenzen. Die Atomisierung der Probe im Graphitrohr wird über ein vorgewähltes Temperaturprogramm gesteuert. Das Temperaturprogramm besteht im Prinzip aus vier verschiedenen Stufen: zum ersten aus einer Trocknung (10-30 s), zum zweiten aus einer thermischen Vorbehandlung, um Begleitsubstanzen möglichst weitgehend abzutrennen, drittens aus der eigentlichen Atomisierungs-stufe (2-3 s) und abschließenden aus einer Reinigungsstufe. Zum Atomisieren des Elements wird ein rascher Temperaturanstieg gewählt, da die Atomwolkendichte und damit die Empfindlichkeit um so größer wird, je schneller die Atomisierung erfolgt. Die Atomisierungstemperatur sollte auch nicht wesentlich überschritten werden, da bei höheren Temperaturen die Ausdehnung des Gases und die Verluste durch Diffusion aus dem Absorptionsraum zunehmen. (Naumer und Heller, 1997; Welz und Sperling, 1997) Der Meßbereich der GF-AAS liegt in der Größenordnung von pg bis ng bzw. bei Dosiervolumina von üblicherweise 10 bis 50 µl im Konzentrationsbereich von ng/l bis µg/l. Material und Methoden 4.2.1.1 29 Interferenzen in der GF-AAS Die Anwesenheit von Begleitsubstanzen neben dem zu bestimmmenden Element können Störungen (Interferenzen) verursachen. Diese Störungen werden eingeteilt in spektrale und nicht spektrale Interferenzen. Die einzige bedeutende spektrale Interferenz ist die sog. Untergrundabsorption. Die zusätzliche Absorption von Strahlung durch Moleküle gasförmiger Stoffe und die Strahlungsstreuung an Partikeln verursachen diese Untergrundabsorption. Ursache für diese Interferenz ist eine nicht vollständige Entfernung von Matrixbestandteilen während der Vorbehandlungsphase. Shekiro und Skogerboe (1988) konnten durch Aufnahmen von Absorptionsspektren während der Atomisierung zeigen, dass die Störungen von Natriumchlorid und anderen Chloriden durch eine zusätzliche Molekülabsorption zur eigentlichen Atomabsorption verursacht wurden. Die Spektren der Chloride sind durch breite Absorptionsmaxima in einem Bereich von 200-300 nm gekennzeichnet. Der entscheidene Unterschied zwischen der Atomabsorption und der Molekülabsorption besteht im Spektralbereich der Absorption. Die Atomabsorption hat einen sehr engen Spektralbereich von nur wenigen Tausendstel Nanometer. Im Gegensatz dazu ist die Molekülabsorption relativ breitbandig. Dieser Unterschied wird in der AAS ausgenutzt, um die Interferenzen durch die Untergrundabsorption zu beseitigen. In der GFAAS wird die Untergrundkorrektur mit einem Kontinuumstrahler oder durch Ausnutzung des Zeeman-Effekts durchgeführt. Für die Untersuchungen wird ein GF-Atomabsorptionsspektrometer mit Kontinuumstrahler (D2-Lampe) verwendet. Auf eine Erläuterung des Zeeman-Effektes wird deshalb verzichtet. Die Untergrundkorrektur mit einem Kontinuumstrahler beruht auf dem Prinzip, dass die Absorption in rascher Folge (z.B. 50 Hz) abwechselnd mit einem Linienstrahler (Hohlkathodenlampe) und einem Kontinuumstrahler (Deuteriumlampe) gemessen wird. Die Strahlung der Hohlkathodenlampe wird durch die Atom- und die Untergrundabsorption gleichermaßen geschwächt, die des Kontinuumstrahler dagegen praktisch nur durch die Untergrundabsorption, da die Atomabsorption im Vergleich zu der eingestellten Bandbreite (0,2 nm) nur in einem sehr engen Spektralbereich erfolgt. Die Extinktion der Probenatome wird durch Substrahieren der Extinktion der Kontinuumstrahlung von der der Linienstrahlung bestimmt. Das Kompensationsverfahren funktioniert allerdings nur bis zu einer Untergrundextinktion von 1 zuverlässig. Bei starken spektralen Interferenzen, die nicht mit einer Untergrundkompensation beseitigt werden können, ist der Einsatz von sog. chemischen Modifiern nötig. Der Zusatz solcher Modifier soll ermöglichen, dass die störenden Matrixbestandteile vor dem Atomisierungsschritt aus dem Graphitrohr entfernt werden. Der Modifier kann zum einen den Siedepunkt der Matrix erniedrigen (Matrixmodifier: z.B. Ammonium- 30 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren nitrat) oder den Analyten stabilisieren (Analytmodifier: Palladiumnitrat) und somit höhere Verarschungstemperaturen erlauben. (Naumer und Heller, 1997; Welz und Sperling, 1997; Schlemmer und Radziuk, 1999) Bei den nicht-spektralen Interferenzen wird die Anzahl Atome des zu bestimmenden Elements im Absorptionsvolumen direkt beeinflusst. In der GF-AAS spielen zwei Arten von nicht-spektralen Interferenzen eine besondere Rolle. Die sogenannte Verdampfungsinterferenz tritt dann auf, wenn das zu bestimmende Element in Anwesenheit einer Begleitsubstanz bei einer niedrigeren Temperatur verflüchtigt wird als in Abwesenheit dieser Substanz. Es besteht die Gefahr, dass während der thermischen Vorbehandlung Verluste an dem zu bestimmenden Element auftreten. Die sog. Gasphaseninterferenz wird beobachtet, wenn das betreffende Element nicht vollständig in Atome dissoziiert. Ursache hierfür kann in einer Stabilisierung des Elements durch die Matrix gesehen werden. Die nicht-spektralen Störungen können durch eine Standardaddition korrigiert werden. (Naumer und Heller, 1997; Welz und Sperling, 1997; Schlemmer und Radziuk, 1999) 4.2.2 Gaschromatographie (GC) Zur Trennung von Stoffgemischen werden in der chemischen Analytik chromatographische Verfahren eingesetzt. Aufgrund verschiedener Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären und der mobilen Phase werden diese unterschiedlich lange zurückgehalten (retardiert), was zur Auftrennung des Gemisches führt. Das Prinzip der Adsorptionschromatographie sind verschieden starke Adsorptionen der Analyten an der stationären Phase. Die Verteilungschromatographie beruht auf unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten der Analyten in beiden Phasen. Die GC, vor allem die Kapillar-GC stellt im Hinblick auf die Messempfindlichkeit und Auflösung der chromatographischen Trennung (Trennleistung) ein besonders leistungsfähiges Verfahren dar. Die flüssige stationäre Phase befindet sich als durchgehender und gleichmäßiger Film von etwa 0,05 bis 10 µm Dicke auf der Innenwand einer Kapillare, die von einem inerten Trägergas als mobile Phase durchströmt wird. Voraussetzung für die GC ist, daß sich die Analyten möglichst unzersetzt verdampfen lassen. Die Maskierung polarer funktioneller Gruppen wie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen durch eine Derivatisierung verbessert die Flüchtigkeit und Gaschromatographierbarkeit. Dies geschieht durch die Herabsetzung polarer Wechselwirkungen mit freien Silanolgruppen des Säulenmaterials, die zur unsymmetrischen Signalverbreiterung (Peaktailing) und Substanzverlust führen können. Material und Methoden 31 Die GC kann durch Auswahl von stationären Phasen unterschiedlicher Polaritätsgrade und Optimierung der Temperaturprogramme an verschiedenste Trennprobleme angepasst werden. Die wichtigste Klasse der stationären Phasen bilden die Polysiloxane, die sich durch Einführung verschiedener Substituenten, wie Methyl-, Phenyl-, Vinyl-, Cyanopropyl- und Trifluorpropylgruppen in ihrer Polarität variieren lassen. Mit der GC können eine Vielzahl empfindlicher sowohl universeller (Flammenionisationtsdetektor - FID) als auch selektiver Detektoren (Atomemissionsdetektor, Massenspektrometer) gekoppelt werden. Ausführliche Grundlagen der Gaschromatographie finden sich in Übersichtsarbeiten von Jennings (1987) und Schomburg (1987). In der vorliegenden Arbeit wurde die Headspace-GC (HS-GC) in Kombination mit einem FID als Detektorsystem angewandt. Im folgenden soll auf Besonderheiten dieser eingesetzten Techniken näher eingegangen werden. 4.2.2.1 Statische Headspace-Gaschromatographie Die statische Headspace-GC nutzt die Gleichgewichtsverteilung von Analyten zwischen einer flüssigen oder festen Probenmatrix und einem darüber befindlichen Gasraum (head space) in einem geschlossenen, thermostatisierten Gefäß. Ein Teil des mit den Analyten beladenen Gasraums wird der gaschromatographischen Analyse zugeführt. In der Praxis erfolgt dies fast immer automatisiert, so dass von einer kombinierten Extraktions-/Injektionsmethode gesprochen werden kann. Die Headspace-GC bietet den Vorteil, dass die Analyten gasförmig ohne Lösungsmittel auf die Säule überführt werden. Dadurch wird die Verunreinigung des Systems mit nicht verdampfbaren Probenbestandteilen vermieden. Lösungsmittelpeaks und die damit verbundenen möglichen Interferenzen mit den Analyten treten nicht auf. Für empfindliche Bestimmungen sind hohe Konzentrationen in der Gasphase günstig. Sie treten bei kleinem Verteilungskoeffizienten und / oder großem Probevolumen (kleinem Phasenverhältnis) auf. Der Verteilungskoeffizient ist umgekehrt proportional zur HenryKonstante und damit abhängig sowohl vom Dampfdruck als auch von der Wasserlöslichkeit einer Substanz (Schwarzenbach et al., 1993). Deshalb können auch Verbindungen mit niedrigem Dampfdruck analysiert werden, wenn ihre Wasserlöslichkeit gering ist. Quantitative Messungen sind besonders einfach, wenn der Verteilungskoeffizient unabhängig von der Analytkonzentration ist, d.h. im Bereich „ideal verdünnter Lösung“ eines Analyten (Geltungsbereich des Henryschen Gesetzes; Kolb et al., 1995). Dieser Bereich ist stark abhängig von den chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Substanz; er reicht von etwa 0,1% (unpolare, wenig lösliche Verbindungen) bis über 10% (niedere Alkohole; Kolb et al., 1995). 32 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren Der lineare Bereich ist damit in den meisten Fällen auch für Messungen wenig „idealer“ Verbindungen ausreichend, da die überwiegende Zahl der Headspace-Anwendungen für diese Substanzen im ppb - ppm Bereich arbeiten. 4.2.2.2 Flammenionisationsdetektion Das Prinzip des Flammenionisationsdetektors (FID) basiert auf der Verbrennung des GCEluates in einer Wasserstoffflamme. Kohlenstoffhaltige Verbindungen bilden bei ihrer Verbrennung positiv geladene Zwischenprodukte (Formylkation), die an einer Kathode in der Nähe der Flamme detektiert werden können. Der FID zeigt nahezu alle Kohlenstoffverbindungen mit annähernd gleicher Empfindlichkeit an (Ausnahmen sind stark oxidierte C1Verbindungen wie CO2, Ameisensäure oder Tetrachlormethan). Er gilt deshalb neben dem Wärmeleitfähigkeitsdetektor als der unselektivste GC-Detektor. Die Nachweisempfindlichkeit der Detektion erreicht 50 pg absolut (Mol et al., 1995). Vorzüge des FID sind die hohe Stabilität des Signals, die seltenere Kalibriermessungen erlaubt und der große lineare Meßbereich von 6 Größenordnungen (Mol et al., 1995). 4.2.3 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Die HPLC ist eine trennanalytische Methode für in Flüssigkeiten lösliche Stoffgemische, sie kann aber auch für präparative Zwecke eingesetzt werden. Die mobile Phase ist eine Flüssigkeit (Eluent) und wird im Vergleich zur konventionellen Säulenchromatographie unter hohem Druck durch die Säule gepumpt, wodurch unter anderem die Leistungsfähigkeit gesteigert werden konnte. Im Gegensatz zur GC bei der die Anpassung des Systems an das Trennproblem nur durch Änderung der stationären Phase und bedingt der Temperatur möglich ist, hängt die Trennung bei der HPLC von der Wahl der stationären und (veränderbaren) mobilen Phase und ihrem Zusammenspiel gleichermaßen ab. Aufgrund der unterschiedlichen stationären Phasen werden verschiedene Trennmethoden unterschieden: Die Ausschlußchromatographie, die nach Molekülgröße klassifiziert, die NP-HPLC (NP = normal phase, Normalphase), die auf polaren Wechselwirkungen (Adsorptionschromatographie und Verteilungschromatographie) basiert, die RP-HPLC (RP = reverse phase, Umkehrphase), deren Trenneffekt auf apolaren Wechselwirkungen (Adsorptions- und Verteilungschromatographie) beruht und die Ionenaustauschchromatographie, welche aus Wechselwirkungen der ionischen Gruppen der stationären Phase mit den ionischen Probemolekülen resultiert. (Meyer, 1992) Die HPLC wurde im Rahmen dieser Arbeit für die Bestimmung von Monosacchariden der Zellwandhydrolysate der Algen angewandt. Die Analyse erfolgte mittels Trennung der Zu- Material und Methoden 33 cker an einer Anionenaustauschersäule und anschließender elektrochemischer Detektion (PAD). Die Grundlagen der verwendeten HPLC Methode wird im folgenden näher erläutert. 4.2.3.1 Hochleistungsanionenaustauschchromatographie (HPAEC) mit elektrochemischer Detektion Zur Analytik der neutralen und sauren Monosaccharide der Zellwandhydrolysate wurden Säulen der Firma Dionex verwendet. Am Beispiel der Anionenaustauschersäule Carbopak PA1 von Dionex soll der Aufbau solcher Säulen gezeigt werden. Das Grundgerüst der Carbopak PA1 besteht aus oberflächensulfonierten Polystyrol-Divinylbenzol (PS-DVB) mit einem Vernetzungsgrad von 5%. Dieses polymere Harz (Teilchendurchmesser 10 µm) zeichnet sich durch hohe mechanische und chemische Stabilität im gesamten pH-Bereich (0-14) aus. Träger der eigentlichen Anionenaustauscherfunktionen sind sehr kleine Latexteilchen mit –NR3+Gruppen (∅ = 0,1 µm), die durch elektrostatische Wechselwirkungen auf dem PS-DVB fixiert sind. Analytionen treten nur mit den funktionalisierten Latexteilchen in Wechselwirkung, ein Eindringen in das PS-DVB-Harz ist wegen der elektrostatischen Abstoßung nicht möglich. Aus dieser Säulenkonstruktion resultieren geringe Diffusionswege und ein schneller Massentransport, was sich auf die Trennstufenhöhe positiv auswirkt. Die Retention der Anionen nimmt mit steigendem Molekulargewicht und sinkendem pKa-Wert zu. Für Saccharide ergibt sich deshalb folgende Elutionsreihenfolge: Zuckeralkohole < Monosaccharide < Disaccharide < Uronsäuren < Oligo- und Polysaccharide. Die Retention der anionischen Analyten ist stark von der Hydroxidionenkonzentration und der Ionenstärke im Eluenten abhängig. Acetat- und Carbonationen im Eluenten verkürzen die Retentionzeit der Analyten wegen ihrer höheren Ionenstärke im Vergleich zu Natriumhydroxid. Zur Detektion der Analyten wird die HPAEC mit elektrochemischen oder massenspektroskopischen Detektoren gekoppelt. Als elektrochemischer Detektor wird heute hauptsächlich der gepulste amperiometrische Detektor (PAD) eingesetzt. (Lee, 1990; Stumm, 1994; Weitzhandler et al., 1996; Wunschel et al., 1997; Cataldi et al., 2000) 4.2.3.1.1 Gepulster amperiometrischer Detektor (PAD) Der PAD detektiert den elektrischen Strom, der aus der Oxidation der im alkalischen Eluenten gebildeten Oxyanionen resultiert. Der Aufbau der Dünnschicht-Messzelle des in der Arbeit verwendeten Detektors der Firma Dionex ist in Abb. 4–1 dargestellt. Die Messzelle besteht aus einer Drei-Elektroden-Anordnung, die für eine amperiometrische Arbeitsweise (weniger als 10% Stoffumsatz) ausgelegt ist. Zwischen einer Gold-Arbeitselektrode und einer SilberReferenzelektrode wird ein geeignetes Messpotential angelegt, das mit Hilfe einer Stahl- 34 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren Gegenelektrode (Hilfselektrode) konstant gehalten wird. Das Messpotential wird so gewählt, dass die Analytmoleküle selektiv und empfindlich analysiert werden können. Die Analytmoleküle, die die Messzelle passieren, werden oxidiert, der resultierende Stromfluss wird verstärkt und als Messsignal aufgezeichnet. Bei der gepulsten Arbeitsweise werden in schneller Folge nach dem Messpotential (E1) zwei Potentiale zur Reinigung der Elektrodenoberfläche durchlaufen (1 Zyklus = 720 ms). Bei einem Potential von 0,65 V (E2) werden Oxidationsprodukte entfernt und die Elektrodenoberfläche oxidiert. Das stark negative Potential E3 (-0,8 V) bewirkt die Reduktion des Goldoxidfilms, der die Oxidation von Kohlenhydraten in alkalischer Lösung inhibiert. (Stumm, 1994) Abb. 4–1: Messzelle des PAD (Firma Dionex) Um die Potentiale E1-E3 optimal setzen zu können, ist die Kenntnis der elektrochemischen Prozesse, die das jeweilige System aus Eluent, pH-Wert, Analyt und Elektrode charakterisieren und deren Einfluss auf das Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich. Mit Hilfe der cyclischen Voltametrie können die geeigneten Messpotentiale ermittelt werden. So findet die Oxidation von Kohlenhydraten zwischen 0 und 0,25 V statt, gleichzeitig steigt jedoch auch der Hintergrundstrom, der aus der Oxidation der Goldelektrode zu Goldoxid resultiert. Das Messpotential wird daher zwischen 0,05 und 0,1 V gewählt. (Larew und Johnson,1989) 4.2.4 FT-IR Spektroskopie Die FT-IR Spektroskopie beruht auf einer Anregung von Schwingungen bzw. Rotationen in Molekülen mittels infrarotem Licht. In der FT-IR Spektroskopie werden drei Teilbereiche unterschieden. Das kurzwellige Nahe Infrarot (NIR: 800 nm – 2,5 µm), das Mittlere Infrarot (MIR: 2,5 – 50 µm) und das langwellige Ferne Infrarot (FIR: 50 – 1000 µm). Infrarotaktiv Material und Methoden 35 sind nur Rotationen und Schwingungen von solchen Molekülen, die entweder ein permanentes Dipolmoment aufweisen oder bei denen sich während des Schwingungs- bzw. Rotationsvorganges das Dipolmoment ändert. Die periodische Änderung eines Dipolmoments kann nur mit ganz bestimmten Frequenzen erfolgen. Eine Energieabsorption tritt ein, wenn die Lichtfrequenz mit einer der möglichen Dipolfrequenzen übereinstimmt. Die Intensität der Absorption hängt von der Größe der Dipolmomentänderung und von der Richtung ab, die der Dipol zum Lichtvektor einnimmt. Aus apparativen Gründen wird bei der FT-IR Spektroskopie nicht direkt die spektrale Absorption der Untersuchungssubstanz, sondern die komplementäre Durchlässigkeit oder Transmission T gemessen. In FT-IR Spektren wird die Wellenzahl ν (cm-1) über der Transmission T aufgetragen. Die Fläche unter den Bandenmaxima sind durch die absorbierte Strahlungsenergie charakterisiert. Die Verwendung der Extinktion anstatt der Transmission ist ebenfalls möglich (E=lg (100 / T)). Zum detaillierten apparativen Aufbau sei auf die Literatur verwiesen. (Günzler und Heise, 1996; Naumer und Heller, 1997) FT-IR Untersuchungen können an Proben in allen Aggregatzustände ausgeführt werden. Für Gase und Flüssigkeiten werden spezielle Küvetten verwendet. Für feste Materialien wird vor allem die KBr-Presstechnik angewendet, die auch Gegenstand in dieser Arbeit war. Bei dieser wird die Substanz mit reinstem, getrocknetem Kaliumbromid (KBr) verrieben und das Pulver anschließend unter hohem Druck zu KBr-Scheiben verpresst. Die Eigenschaft des kalten Fluss bei Drücken von etwa 0,7 – 1,0 GPa der Alkalihalogenide wird hierbei ausgenutzt. Unter diesen Drücken sintert das Material und lässt sich zu einer durchsichtigen, einkristallähnlichen Scheibe verformen. Die KBr-Scheiben sind bis zu einer Wellenzahl von 400 cm-1 durchlässig. (Günzler und Heise, 1996; Naumer und Heller, 1997) 4.2.5 Rasterelektronenmikroskopie (REM)- Röntgenmikroanalyse Der Einsatzbereich der REM dringt immer stärker in alle Bereiche vor, in denen feste Materie untersucht wird und das Lichtmikroskop wegen seiner begrenzten Auflösung nicht ausreichend ist. Das Lichtmikroskop hat eine Auflösungsgrenze von etwa 1 µm und die Schärfentiefe bei hohen Vergrößerungen beträgt ebenfalls nur etwa 1 µm. Das Auflösungsvermögen eines konventionellen REM liegt bei etwa 4 nm, und die Schärfentiefe ist stets ein Vielfaches des lateralen Auflösungsvermögens. Die Bilderzeugung geschieht beim REM durch sequentielle Übertragung der Informationen aller Bildpunkte, die mit einem Elektronenstrahl abgetastet werden. Der Elektronenstrahl wird von einer Kathode erzeugt und in Richtung Anode beschleunigt. Die Beschleunigungsspannung für die Elektronen erstreckt sich von einigen 100 V bis maximal 50 kV. Der Elekt- 36 Grundlagen der angewandten analytischen Verfahren ronenstrahl wird durch entsprechende Linsen bis zur Oberfläche der Probe auf einem Querschnitt von wenigen Nanometern gebündelt. Beim Eintritt der Elektronen (Primärelektronen) in den Festkörper treten verschiedene Arten von Wechselwirkungen mit den Atomen auf. Die von der Oberfläche der Probe emittierten Elektronen werden von Detektoren (Photomultiplier) aufgefangen und zu einem Bild verarbeitet. Die emittierten Elektronen werden nach ihrem Energiegehalt in Rückstreuelektronen (RE; E > 50 eV) und Sekundärelektronen (SE; E ≤ 50 eV) eingeteilt. RE haben eine elastische oder eine unelastische Streuung am Kernpotential erfahren. Elastisch gestreute Elektronen erleiden bei dieser Wechselwirkung keine Energieverluste. Bei der unelastischen Streuung verlieren die Elektronen einen Teil ihrer Energie durch Bremsstrahlung im Kernfeld. Die Ausbeute an RE ist Abhängig von der Ordnungszahl des Atoms. Bei gleicher Primärelektronenenergie wird der Rückstreuanteil mit steigender Ordnungszahl größer. Daraus ergibt sich der Kontrast und die relative Empfindlichkeit im RE-Bild. Bereiche der Probe mit Elementen höherer Ordnungszahl sind im RE Bild als deutlich hellere Spots zu erkennen. RE-Bilder sind deshalb bei Fragestellungen zur Elementzusammensetzung der Oberfläche sehr hilfreich. Zur Betrachtung der Oberfläche und zur Charakterisierung bestimmter Strukturen oder Formen werden hauptsächlich die SE verwendet. SE können die Probe nur aus einer sehr dünnen Schicht von einigen Nanometern an der Oberfläche verlassen, wodurch eine hohe Auflösung der Bilder erreicht werden kann. Als Sekundärelektronen werden Elektronen der Probeatome bezeichnet, die nach der Wechselwirkung mit Primärelektronen oder auch RE die Probe mit einer Energie von durchschnittlich 2-5 eV verlassen. Die Primärelektronen können bei ausreichender Energie auch innere Elektronenschalen der Probeatome ionisieren. Bei der Rekombination entsteht eine charakteristische Röntgenstrahlung des betreffenden Elementes. Die Röntgenstrahlen werden von einem Detektor (Siliziumdetektor) aufgezeichnet und zu einem Röntgenspektrum der Probe verarbeitet. Die sog. Röntgenmikroanalyse ermöglicht es somit, die Elementzusammensetzung der Oberfläche zu analysieren. Für weiterführende Details zur REM und Röntgenmikroanalyse wird auf die Übersichtsarbeit von Reimer (1998) verwiesen. Material und Methoden 4.3 37 Metallanalytik – Methodenentwicklung Details zu den verwendeten Chemikalien und Materialien sind in Tab. A–7 gegeben. 4.3.1 GF-AAS Die Parameter des verwendeten GF-AAS sind im Anhang Tab. A–1 dargestellt. Die Methodenentwicklung orientierte sich an den DIN Normen für die Metalle und den Vorgaben des GF-AAS Herstellers. Die Analytik der Metalle erfolgte für Cd nach DIN EN ISO 5961 (1995), für Cu nach DIN 38406-7 (1991), für Ni nach DIN 38406-11 (1991), für Pb nach DIN 38406-6 (1981, 1998) und für Zink nach DIN 38406-8 (1980). Die Temperaturprogramme für die Metalle wurden durch Variation der Vorbehandlungs- und Atomisierungstemperatur optimiert. Im Anhang in Tab. A–3 sind die verwendeten Temperaturprogramme dargestellt. Die Parameter wurden in regelmäßigen Abständen überprüft. Die verwendeten pyrolytisch beschichten Graphitrohre hatten im Durchschnitt eine Lebensdauer von über 1000 Einzelanalysen. In der Laborroutine wurden deshalb die Graphitrohre nach 1000 Einzelanalysen gewechselt. Alle Standards und Proben wurden zur Stabilisierung mit einer 0,1 N HNO3 verdünnt (ISO 5667-3, 1994). Proben, die unverdünnt vermessen wurden, wurden mit konzentrierter Salpetersäure entsprechend angesäuert. Die Haltbarkeit der verwendeten Standardlösungen wurde an den entsprechenden DIN-Normen bzw. den Angaben der Hersteller orientiert. Nach DIN sind saure Lösungen (0,1 N HNO3) mit einem Gehalt von 10 mg/L Cd, Cu, Ni bzw. Pb mindestens 1 Monat, von 5 mg/L Zn mindestens 1 Woche haltbar. Alle anderen Standards wurden täglich neu angesetzt. Die Eichung erfolgte mit einer Mikropipettiereinheit (MPE). Es war so nur notwendig, den höchsten Eichstandard herzustellen. Alle weiteren Standards wurden automatisch von der MPE nach entsprechender Programmierung hergestellt. Die Eichung des System erfolgte mit dem entsprechenden Metall täglich. Jede Messreihe wurde mit einer abschließenden Vermessung des höchsten Standards zur Kontrolle der Stabilität des Systems beendet. Alle Standards und Proben wurden fünffach im GF-AAS vermessen und gemittelt. Die relative Standardabweichung (RSD) der GF-AAS betrug bei allen Versuchen unter 3 %. Die Auswertung erfolgte mittels linearer oder quadratischer Regression der Daten aus der Kalibrierung. Aus den Regressionsdaten wurden die Konzentration des entsprechenden Metalls in der Probe berechnet. 38 Metallanalytik – Methodenentwicklung Im Verlauf des Projektes mussten eine Vielzahl von Proben vom ppb bis zum ppm Bereich untersucht werden. Die Mehrzahl der Proben befand sich im ppm-Bereich. Der Standardarbeitsbereich der GF-AAS befindet sich jedoch Abhängig vom Metall im mittleren bis unteren ppb-Bereich. Somit wäre für eine Vielzahl von Proben ein hoher Arbeitaufwand aufgrund von zusätzlichen Verdünnungen und daraus resultierend ein größerer zufälliger Fehler die Folge. Aus diesem Grunde wurde für jedes Metall neben dem ppb-Arbeitsbereich eine Methode im ppm-Arbeitsbereich entwickelt. Die Empfindlichkeit in der AAS wird neben der Atomisierungstechnik ganz entscheidend von der Wahl der Wellenlänge der Absorptionslinie des Elementes beeinflusst (Kap. 4.2.1). Neben der empfindlichsten Linie gibt es noch weitere Nebenlinien, die von den Metallen absorbiert werden (Welz und Sperling, 1997). Diese sind dann analytisch nutzbar, wenn deren Intensität ausreichend ist, um mit der Untergrundkompensation abgeglichen zu werden. Für alle Metalle konnte jeweils eine verwendbare Wellenlänge gefunden werden, wodurch der Arbeitsbereich des GF-AAS in den ppm Bereich erweitert werden konnte (Anhang Tab. A–2). In Tab. 4–3 sind die verwendeten linearen Arbeitsbereiche für die fünf Metalle dargestellt. Tab. 4–3: Arbeitsbereiche der untersuchten Metalle mittels GF-AAS Arbeitsbereich Cd Cu Ni Pb Zn ppb 0,2 - 5 1 – 25 4 - 100 4 - 100 4 – 80 ppm 0,04 - 1 0,04 - 1 0,04 - 1 0,4 - 10 0,4 – 10 Zur Vermeidung von Kontaminationen wurden in den beiden Arbeitsbereichen immer separate Maßkolben, Messbecher usw. verwendet. 4.3.2 Mikrowellenaufschluss Die Parameter des verwendeten Mikrowellenaufschlussgerätes sind im Anhang Tab. A–4 dargestellt. 200 - 500 mg der Biomasse werden in speziellen PFA Behältern mit 5 ml HNO3 (65%) und 2 ml H2O2 (30%) versetzt und in einen Druckaufschlussbehälter eingesetzt. Der Aufschluss der Probe erfolgte im Mikrowellenofen mit einen speziellen Aufschlussprogramm (Anhang Tab. A–5). Das Programm wurde an Vorschriften des Herstellers angelehnt. Nach dem Abkühlen der Probe wurde das Aufschlussgefäß vorsichtig geöffnet und die Proben in einen 25 mL Maßkolben überführt und mit Wasser aufgefüllt. Um Kontaminationen zu vermeiden und eine Reproduzierbarkeit zu gewährleisten ist es notwendig, das alle verwendeten Kunststoffgefäße vor jedem Aufschluss mit konzentrierter Salpetersäure gespült werden. In Material und Methoden 39 der Routine wurden jeweils 3-4 parallele Ansätze pro Probe und 2 Blindwerte aufgeschlossen. Die Analytik der Metalle erfolgte nach Kap. 4.3.1. 4.3.3 Flammenphotometrie Die Parameter des verwendeten Flammenphotometers sind im Anhang Tab. A–6 dargestellt. Die Flammenphotometrie wurde zur Analyse von Calzium verwendet, da dieses Element mittels GF-AAS aufgrund von Kontaminationen schwer zu bestimmen ist. Die Durchführung erfolgte analog zu Kap. 4.3.1. Der Arbeitsbereich für Calzium lag zwischen 5 und 25 ppm. Die Auswertung erfolgte mittels linearer Regression der Daten aus der Kalibrierung. Aus den Regressionsdaten wurde die Konzentration des entsprechenden Metalls in der Probe berechnet. 4.4 Biosorptionsuntersuchungen – Methodenentwicklung Details zu den verwendeten Chemikalien, Materialien und Geräten sind in Kap. 4.1 und in Tab. B–1 gegeben. 4.4.1 Probenvorbereitung Die frischen Algenzellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Anschließend wurden die Algen mit Wasser gewaschen, um Nährmedienbestandteilen zu entfernen. Nach Erreichen einer Leitfähigkeit im Waschwasser kleiner 10 µS/cm und einem pH-Wert kleiner 7, wurde die aufkonzentrierte Algensuspension eingefroren Die gefrorenen Proben wurden anschließend gefriergetrocknet. Die Klassierung der gefriergetrockneten Biomasse erfolgte nach Zerkleinerung in einem Mörser bzw. bei größeren Chargen mittels einer Labormühle durch Siebe auf eine Größe von < 250 µm. Die Lagerung erfolgte im Exsikkator. 4.4.2 Biosorptionsversuche Die gesamten Versuche wurden in speziellen Zentrifugenröhrchen (10 ml) aus Polycarbonat (PC) durchgeführt Diese zeichnen sich durch eine hohe Stabilität während der Zentrifugation (bis 50000*g), einer großen Inertheit gegenüber Säuren und Schwermetallen (keine Adsorption an den Wänden) und einer großen Temperaturbeständigkeit (bis 130 °C) aus. Ein weiterer Vorteil bei der Benutzung der PC-Zentrifugenröhrchen ist ihre variable Einfüllmenge. Für die Biosorptionsexperimente wurden 20 mg Biomasse in 9 ml Metallsalzlösung (pH 5-6) suspendiert. Die Batchversuche wurden nach 30 min durch Zentrifugation (10 min; 10000*g) der Suspension abgebrochen und der Überstand mittels GF-AAS analysiert. Die Versuche 40 Biosorptionsuntersuchungen – Methodenentwicklung wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kontrolle des pH-Wertes erfolgt vor und nach jedem Batchversuch. Jeder Sorptionsversuch wurde mit wenigsten zwei parallelen Ansätzen durchgeführt. Betrug die RSD der parallelen Ansätze mehr als 5 %, so wurde der Versuch entsprechend wiederholt. Um Kontaminationen und Wechselwirkungen der Metalle mit den Zentrifugenröhrchen festzustellen, wurden zu jedem Versuch Ansätze ohne Biomasse vermessen. Desweiteren erfolgte eine Kontrolle der Biomasse durch Desorption von unbeladenen Algen. Mit Hilfe der Massenbilanz (Gl. 4–2), unter Berücksichtigung des Blindwertes, konnte anschließend die adsorbierte Metallmenge (qeq, mmol/g) errechnet werden. Gl. 4–2: c0 *V + m * q0 = cg *V + m * qeq Unter der Voraussetzung, dass die Anfangsbeladung q0 der Alge vernachlässigbar ist, lässt sich Gl. 4–2 nach qeq der Beladung der Alge im Gleichgewichtszustand umstellen (Gl. 4–3): Gl. 4–3: qeq = V * (c0 - cg) / m V ist das Volumen der Metallsalzlösung, c0 die Anfangskonzentration, cg die Gleichgewichtskonzentration und m das Gewicht der Biomasse. Folgte der Adsorption direkt eine Desorption, so wurde der Überstand durch dekantieren entfernt und der verbleibende Rest ausgewogen, der bei der Auswertung berücksichtigt wurde. Nach Zugabe von 9 ml des Desorptionsmittels wurde die Probe im Überkopfschüttler 30 min geschüttelt. Nach Zentrifugation der Probe wurde der Überstand vermessen (Kap. 4.3.1). 4.4.2.1 Kinetik der Biosorption Zur Durchführung der Kinetikuntersuchung wurde die Versuchszeit der Biosorptionsversuche variiert. Die weiteren Parameter wurden nicht verändert. Die erste Probe, mit Kontaktzeit 120 min, wurde zum Zeitpunkt to in den Schüttler gestellt. Alle weiteren Proben kamen im entsprechenden Zeitabstand dazu. Zum Zeitpunkt t120= 120 min wurden alle Proben gleichzeitig zentrifugiert, und wie in Kap. 4.4.2. weiterbehandelt. Des weiteren wurde zur Bestimmung der Totzeit eine Probe nicht geschüttelt, sondern nur mit der Hand kurz aufgeschlemmt und sofort wieder abzentrifugiert. 4.4.2.2 Aufnahmen von Isothermen Die Aufnahme der Isothermen erfolgte durch Variation der Ausgangskonzentration der Metalle in Lösung. Die weiteren Parameter wurden nicht verändert. Die Isothermen wurden anschließend mit dem Adsorptionsmodell nach Langmuir (Gl. 2–1 und Gl. 2–2) modelliert und Material und Methoden 41 die entsprechenden Parameter qmax und b berechnet. Diese Parameter dienen zum quantitativen Vergleich der Biosorbenzien untereinander. 4.4.2.3 pH- und Salz-Abhängigkeit der Biosorption Die Untersuchungen erfolgte durch Variation des pH-Wertes bzw. der Salzkonzentration bei konstanter Metallkonzentration. Der pH-Wert wurde mit einer 0,1 N Salzsäure bzw. 0,1 N Natriumhydroxidlösung eingestellt. Als Konkurrenzsalze wurden Calzium und Natrium in verschiedenen Konzentrationen einzeln verwendet. Alle weiteren Parameter wurden nicht verändert. 4.4.2.4 Selektivität der Biosorption Die Seletivität der Biosorption wurde durch Untersuchung der Konkurrenz der Metalle in äquimolaren Mehrmetalllösungen (2-5) bestimmt. Die Versuche erfolgten durch Variation der Anzahl der Metalle in einer Lösung und durch Variation der Ausgangskonzentrationen der Mehrmetalllösungen. Jeder Versuch wurde mit wenigsten drei parallelen Ansätzen durchgeführt. In den Überständen wurden die entsprechenden Metallkonzentrationen analog 4.3.1 analysiert. Alle weiteren Parameter wurden nicht verändert. 4.4.2.5 Anwendung der Biosorption auf ein reales Bleiabwasser Ein Akkumulatorenhersteller aus Berlin stellte dem Projektbereich ein Bleiabwasser für Biosorptionsuntersuchungen zur Verfügung. Angaben über die Zusammensetzung des Abwassers wurden von der Firma nicht gegeben. Somit erfolgte vor der eigentlichen Untersuchungen eine chemische Analyse des Abwassers. Die Schwermetalle wurden analog zu Kap. 4.3.1 bestimmt. Zur Beurteilung der weiteren Elementgehalte des Abwassers wurden Analysen mittels AAS und ICP-OES vom Institut für Angewandte Geowissenschaften I der TU Berlin im dortigen geologischem Zentrallabor (GeoLab) durchgeführt. Summenparameter, wie Ammonium-, Nitrat-, Nitrit-, Sulfatgehalt, TOC und TIC, wurden mit den entsprechenden KüvettenTestsystemen von der Dr. Lange GmbH ermittelt. Die Details zu den verwendeten Tests sind im Anhang in Tab. B–2 zusammengefasst. Die Biosorptionsuntersuchungen mit dem Abwasser erfolgten analog zu Kap. 4.4.2. 4.5 Charakterisierung der Bindungstellen – Methodenentwicklung Details zu den verwendeten Chemikalien, Materialien und sonstigen Geräten sind im Anhang in Tab. C–1 gegeben. 42 4.5.1 Charakterisierung der Bindungstellen – Methodenentwicklung Elementaranalyse Die Elementaranalyse der untersuchten Algen wurde in Kooperation mit Dr. Hartmann vom Institut für Organische Chemie der Humboldt Universität zu Berlin durchgeführt. Die Elementgehalte an Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Schwefel wurden mit dem Elementaranalysator CHNS-932 der Leco Instrumente GmbH, Kirchheim analysiert. Die Analyse des Phosphorgehaltes der Biomassen erfolgte nach einer Methode von Püschel und Wittmann (1960). Nach Aufschluss der Biomasse wurde Phosphor volumetrisch mit einer CerMaßlösung (Ind. Eriochrom T) bestimmt. 4.5.2 Bedeutung von Carboxylgruppen für die Biosorption 4.5.2.1 Blockierung der Carboxylgruppen Die freien Carboxylgruppen der Algen wurden nach einer Methode von Gardea-Torresday et al. (1990) durch eine 48stündige Methylierung blockiert. Die Methylierung erfolgte in salzsaurem Methanol bei Raumtemperatur. 500 mg Algen wurden mit 35 ml Methanol und 0,3 ml konz. Salzsäure auf einem Schüttler 48 Stunden vermischt. Die Reaktion wurde mit Wasser gestoppt und die modifizierte Biomasse neutral gewaschen und wie unter Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Mit den behandelten Algen wurden Adsorptionsversuche analog zu Kap. 4.4.2 durchgeführt. 4.5.2.2 Bestimmung des Carboxylgruppengehalts Die Bestimmung des Carboxylgruppengehaltes erfolgte durch Hydrolyse der methylierten Algen und Quantifizierung des freigesetzten Methanols. 10 mg der modifizierten bzw. 20 mg der unbehandelten Biomasse wurden mit 1,25 ml Puffer pH 5,0 (0,005 M Natriumcitrat in 0,1 M Natriumchlorid) und 0,1 ml 1 M Natriumhydroxid vermischt. Die Probenvials wurden verschlossen und über Nacht bei 8°C inkubiert. Anschließend wurde nach Zentrifugation der Proben ein aliquoter Teil (800 µl) in entsprechende Headspacegefäße überführt. Nach Zugabe von 150 µl 0,082 M Natriumcitrat (pH 3) und 50 µl internen Standard (0,8 g/L 2-Propanol) erfolgte die quantitative Bestimmung des freigesetzten Methanols mittels Headspace-GCFID. Zur Kontrolle wurden Ansätze der modifizierten und unbehandelten Algen ohne Zusatz von Natriumhydroxid untersucht. 4.5.2.2.1 Analyse des Methanols mittels HS-GC-FID Die Parameter des verwendeten HS-GC-FID Systems sind in Tab. C–2 beschrieben. Die Proben und Standards wurden mindestens 60 min im Ölbad des Autosamplers auf 80°C tempe- Material und Methoden 43 riert. Die Spritzentemperatur wurde auf 90°C eingestellt, um Kondensation der Analyten und von Wasserdampf in der Spritze zu minimieren. Das Injektionsvolumen betrug 2 ml. Die Quantifizierung des Methanols erfolgte mit einem internen Standard. Als interner Standard wurde 2-Propanol verwendet. Zur Bestimmung des Responsefaktors wurden wässrige Lösungen von Methanol im Konzentrationsbereich von 2 – 200 mg / L verwendet, die den internen Standard in einer Konzentration von 40 mg /L enthielten. Analog zu Kap. 4.5.2.2 betrug das Volumen in den Headspacegefäßen jeweils 1 ml. Die so hergestellten wässrigen Standardlösungen wurden analysiert und der Responsefaktor (Rf) nach Gl. 4–4 bestimmt. Gl. 4–4: Rf = (FISTD mAnalyt) / (FAnalyt mISTD) FISTD ist die Peakfläche des internen Standards, FAnalyt die Peakfläche des Analyten, mAnalyt bzw. mISTD sind die Gehalte der entsprechenden Substanzen in der Lösung. Die aus den verschiedenen Standards ermittelten Responsefaktoren wurden gemittelt und der resultierende Rf für die Bestimmung der Methanolgehalte der Proben nach Gl. 4–5 verwendet. Gl. 4–5: mAnalyt = (FAnalyt mISTD Rf) / FISTD Zur Kontrolle der Zuverlässigkeit der Messung sowie zur Absicherung der Meßwerte wurden bei jeder Messreihe entsprechende Standards vermessen und der Rf überprüft. 4.5.3 Untersuchung der Polysaccharide der Algenzellwände Zur weiteren Charakterisierung der Bindungsstellen wurden die Polysaccharide der Algenzellwand nach saurer Hydrolyse auf ihre Monosaccharidzusammensetzung mittels HPLC an Anionenaustauschersäulen mit pulsamperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) an einer Goldelektrode untersucht. Die Hydrolyse der Algen (10 – 15 mg) erfolgte mit 2 N Trifluoressigsäure (2 ml) für 1 h bei 125°C unter Stickstoff (Blaschek, 1991). Nach der Hydrolyse wurde die Trifluoressigsäure mit Stickstoff bei 50 °C abgeblasen. Die verbleibenden Hydrolysate wurden in 900 µl Wasser und unter Zugabe von 100 µl des internen Standards (1 g / L Lactose) gelöst, membranfiltriert und auf ihre Monosaccharidgehalte analysiert. Alle Versuche wurden mindestens mit einer Dreifachbestimmung durchgeführt und der Mittelwert der Bestimmung angegeben. Zur Absicherung der Ergebnisse wurden Bildwerte (ohne Trifluoressigsäure) untersucht. Um die Stabilität der einzelnen Kohlenhydrate während der Hydrolyse zu untersuchen, erfolgten Wiederfindungsversuche mit den Standards unter den Hydrolysebedingungen. Die Wiederfindungen für die einzelnen Kohlenhydrate lagen in einem Bereich von 87-105 % und zeigen damit eine ausreichende Stabilität unter den Hydrolysebedingungen. 44 Charakterisierung der Bindungstellen – Methodenentwicklung Die Parameter der verwendeten Kohlenhydratanalytik sind in Tab. C–3 beschrieben. Die Quantifizierung der Zucker erfolgte mit Lactose als internen Standard. Als Kohlenhydratstandards wurden myo-Inositol, Adonitol, Arabinose, Fucose, Fructose, Galactose, Galacturonsäure, Glucose, Glucuronsäure, Maltose, Mannose, Rhamnose, Ribose, Saccharose und Xylose verwendet. Die Standardlösungen (10 g / L) wurden nach ihrer Herstellung portionsweise in 1,5 ml Eppendorfgefäßen eingefroren und bei Bedarf aufgetaut. Zur Bestimmung der Responsefaktoren wurden wässrige Lösungen der Zucker im Konzentrationsbereich von 0,05 – 2 g / L verwendet, die den internen Standard in einer Konzentration von 0,1 g /L enthielten. Die Berechnung der Rf der Standards und die Ermittlung der Probengehalte an den untersuchten Kohlenhydraten erfolgte analog zu Kap. 4.5.2.2.1. Abb. 4–2 zeigt zwei HPAEC Chromatogramme von den verwendeten Standardmischungen. Abb. 4–2: HPAEC-PAD-Chromatogramme von Standardmischungen Vinj = 20µL, Mix 1: c = 0,1 g/L (Ino = myo-Inositol; Ara = Arabinose; Glc = Glucose; Man = Mannose; Suc = Saccharose; Lac = Lactose; Mal = Maltose, GaU = Galacturonsäure; GlU = Glucuronsäure); Mix 2: c = 0,1 g/L (Ado = Adonitol; Fuc = Fucose; Rha = Rhamnose; Gal = Galactose; Xyl = Xylose, Fru = Fructose, Rib = Ribose); HPLC Parameter s. Tab. C–3 Der verwendete optimierte Gradient (Tab. C–3) erlaubt die Auftrennung der Kohlenhydrate in Monosaccharide, Disaccharide und Uronsäuren. Die Uronsäuren und auch Polysaccharide werden an der Anionenaustauscherphase stärker gebunden und können erst durch Zusatz von einem stärkeren Anion 0,5 N Natriumacetat zum Eluenten von der Säule eluiert werden. Material und Methoden 45 Zur Untersuchungen der Hydrolyseextrakte der Algen war es nötig zur Quantifizierung der entsprechenden Kohlenhydrate die Extrakte in unterschiedlichen Verdünnungen zu vermessen. In Abb. 4–3 ist ein Chromatogramm der hydrolysierbaren Kohlenhydrate der Alge C. salina dargestellt. Abb. 4–3: HPAEC-PAD-Chromatogramm der hydrolysierbaren Kohlenhydrate von C. salina Vinj = 20µL, HPLC Parameter s. Tab. C–3 Das Chromatogramm zeigt den unverdünnten Extrakt. Als Hauptkomponenten wurden Glucose (Glc), Galactose (Gal), Mannose (Man) und Adonitol (Ado) gefunden. Galacturonsäure ist zu 1% enthalten. Glucuronsäure war nur in geringen Mengen bestimmbar (0,1 %). 4.5.4 Extraktion von Zellwandbestandteilen Die verwendeten Verfahren orientieren sich an den Untersuchungen von Fehrmann (1993) und Blaschek (1991). 4.5.4.1 Lipophile Extraktion Die Extraktion wurde an einer Soxhlet-Apparatur vorgenommen. In einen Faltenfilter wurden 2 g Algenbiomasse eingewogen. Der Faltenfilter mit der Algenbiomasse wurde in der Soxhlethülse 20 Stunden mit 200 ml einer Mischung aus Dichlormethan/Methanol (1/1, v/v) extrahiert. Die Soxhlethülse wurde nach der Extraktion mit 100 ml Aceton und 100 ml MilliporeWasser gewaschen. Anschließend wurde die gesamte Hülse gefriergetrocknet und die Biomasse wie in Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Es folgten Biosorptionsversuche mit Blei und Zink analog zu Kap. 4.4.2. 46 4.5.4.2 Charakterisierung der Bindungstellen – Methodenentwicklung Hydrophile Extraktion Es wurden 1 g Algenbiomasse eingewogen. Die Algen wurden mit 150 ml Millipore-Wasser 2 Stunden am Rückfluss erhitzt. Die Algen wurden abzentrifugiert und wie in Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Es folgten Biosorptionsversuche mit Blei und Zink analog zu Kap. 4.4.2. 4.5.4.3 Alkalische Extraktion Es wurden 1 g Algenbiomasse mit 100 ml 0,2%iger Natronlauge 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Biomasse wurde mit Wasser neutral gewaschen, abzentrifugiert und wie in Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Es folgten Biosorptionsversuche mit Blei und Zink analog zu Kap. 4.4.2. 4.5.5 FT-IR Spektroskopie Die Parameter der verwendeten Probenvorbereitungsgeräte und des FT-IR Spektrometer sind in Tab. C–4 beschrieben. Zur Untersuchung wurden 1 mg der gefriergetrockneten Algen mit 300 mg KBr vermischt und zu einem Pressling verarbeitet. 4.5.6 Spezifische Oberfläche Die Bestimmung der spez. Oberflächen ausgesuchter Algen erfolgte durch Dr. P. Lorenz von der Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung (BAM) und Herrn A. Schreiber vom Iwan Stranski Institut für Physikalische und Theoretische Chemie der TU Berlin. Zur Ermittlung der spez. Oberfläche wurde die Methode der Gasadsorption von Stickstoff bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs (77 K) nach DIN 66131 angewandt. Wenn der Wert der spez. Oberfläche unter 1 m2 / g lag, wurde Krypton als Sondenmolekül eingesetzt. Nach dieser Methode wurden Stickstoffisothermen aufgenommen, die mit dem Adsorptionsmodel nach Brunauer, Emmett und Teller (BET) ausgewertet wurden. Die Berechnung der spez. Oberfläche erfolgte aus den Parametern der BET Isotherme. 4.5.7 Rasterelektronenmikroskopie (REM) Die Parameter des verwendeten Rasterelektronenmikroskop und des energiedispersiven Röntgenmikroanalysesystem sind in Tab. C–5 beschrieben. Die REM Untersuchungen wurden in Kooperation mit J. Nissen von der Zentraleinrichtung Elektronenmikroskopie der TU Berlin durchgeführt. Die Proben wurden vor der Untersuchung mit einer dünnen Kohlenstoffschicht bedampft. Material und Methoden 4.6 47 Modifizierung der Biomasse - Methodenentwicklung Details zu den verwendeten Chemikalien, Materialien und Geräten sind in Tab. D–1 gegeben. Die nachfolgenden Versuche wurden an C. salina bzw. L. taylorii durchgeführt. 4.6.1 Phosphorylierung mit Phosphorsäure Der zusätzliche Einbau von Phosphatgruppen in die Algenzellwand wurde durch eine Veresterung der freien Hydroxylgruppen der Polysaccharide mit Phosphorsäure in Gegenwart von Harnstoff erreicht. Die Versuchsbedingungen sind an eine Methode von Meisch und Gauer (1998) angelehnt, die dieses Verfahren an Holz und Chitin anwendeten. 1 g Algenbiomasse wurden mit 4,48 g Harnstoff und 25 ml 30 %iger Phosphorsäure in einer Petrischale (∅ 15 cm) vermischt. Der Ansatz wurde für 30 min bei Raumtemperatur belassen und anschließend im Trockenschrank bei 70 °C für 60 min vorgetrocknet. Die eigentliche Reaktion erfolgte in einem auf 200 °C vorgeheizten Muffelofen für 2 h. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 80 ml Zentrifugengläser überführt und mit Wasser neutral und phosphatfrei gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Der Phosphatgehalt wurde mit einem Testkit im Überstand bestimmt. Zur Bestimmung der Phosphatgehalte der modifizierten Alge erfolgte eine Elementaranalyse (Kap. 4.5.1). Zur Charakterisierung der Phosphatgruppen auf der Oberfläche wurden FT-IR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt (Kap. 4.5.5). 4.6.2 Phosphorylierung mit Phosphorylchlorid Die Versuchsbedingungen sind an eine Methode von Gauer (1996) angelehnt Zu einer Suspension von 1 g Biomasse in 10 ml wasserfreien Pyridin wurden unter Rühren 2,3 g (1,37 ml) Phosphorylchlorid hinzugetropft, worauf das Reaktionsgemisch 90 min bei 60 °C erhitzt wurde. Nach Abkühlen wurde das Produkt abzentrifugiert, dreimal mit 10 ml Pyridin und abschließend mit Wasser gewaschen. Zur Hydrolyse des Säurechlorids wurde das Produkt in 50 ml einer 0,2 M Natriumcarbonatlösung suspendiert und eine Stunde bei RT gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde dann mit Wasser neutral und phosphatfrei gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Zur Bestimmung der Phosphatgehalte der modifizierten Alge erfolgte eine Elementaranalyse (Kap. 4.5.1). 4.6.3 Phosphorylierung mit Phosphorpentasulfid Die Versuchsbedingungen sind an eine Methode von Yalpani (1992) angelehnt. 1 g Ausgangsprodukt wurden mit 1 g Phosphorpentasulfid vermischt und für 2 h bei 110 °C erhitzt. Das Feststoffgemisch wurde anschließend mit Ethanol und heißem Wasser gewaschen, um 48 Modifizierung der Biomasse - Methodenentwicklung überschüssiges Phosphorpentasulfid zu entfernen. Die modifizierte Biomasse wurde phosphat- und sulfidfrei gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. Zur Bestimmung der Phosphatgehalte der modifizierten Alge erfolgte eine Elementaranalyse (Kap. 4.5.1). 4.6.4 Carboxymethylierung mit Chloressigsäure Die Versuchsbedingungen sind an eine Methode von Gauer (1996) angelehnt. In einem 100 ml Dreihalskolben wurden 1 g Biomasse in einer Mischung aus 3 g Wasser, 12 g Ethanol und 6,6 g 2–Propanol suspendiert. Anschließend wurden unter N2–Atmosphäre innerhalb von 20 min 1,4 g Natriumhydroxid (50%), danach innerhalb von 15 min 0,86 g Chloressigsäure (80 %) unter kräftigem Rühren hinzugetropft. Die Suspension wurde daraufhin unter Aufrechterhaltung der N2–Atmosphäre auf 70 °C erwärmt und 60 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemisch wurde das entstandene Produkt abzentrifugiert, mit 1 L heißem Wasser gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. 4.6.5 Einbau von Carboxylgruppen durch eine zweistufige Oxidation Die Versuchsbedingungen sind an eine Methode von Krämer (1998) angelehnt. 1 g Algenbiomasse wurde unter Lichtausschluss in 50 ml Natriumperjodatlösung (0,1 M) für 6 h bei RT suspendiert. Anschließend wurde das Produkt abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. 500 mg der oxidierten Biomasse wurden in 25 ml Wasser suspendiert und mit 13 mg Titriplex III und 0,4 ml Wasserstoffperoxid (30%) versetzt. Eine Mischung aus 0,45 g Natriumchlorit und 0,125 ml Essigsäure (99 - 100 %) wurde innerhalb von 10 min bei Raumtemperatur zugetropft. Der pH - Wert wurde während des Zutropfens mit einer Natriumhydroxidlösung (2,5 M) bei pH 5 gehalten. Die Mischung wurde anschließend 4 h bei RT gerührt. Am Ende der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit einer Natriumhydroxidlösung (2,5 M) auf pH 9 gebracht. Das Produkt wurde abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und analog zu Kap. 4.4.1 aufgearbeitet. 49 Biosorptionsuntersuchungen 5 Ergebnisse 5.1 Biosorptionsuntersuchungen 5.1.1 Biosorption von C. vulgaris 5.1.1.1 Adsorptionsisothermen Um die Biosorptionsfähigkeiten (Beladungskapazitäten) der Algen einschätzen zu können, wurden erste Untersuchungen an C. vulgaris durchgeführt. Die Adsorptionsisothermen (Einstoff) für alle 4 Metalle zeigen in Abb. 5–1, dass mit steigender Gleichgewichtskonzentration die Beladung der Alge einem Grenzwert zustrebt. Die Isothermen verlaufen zu Beginn steil. Damit werden bereits bei kleinen Anfangskonzentrationen hohe Beladungen erreicht. Das trifft im besonderen für Blei und Cadmium zu. Im unteren Initialkonzentrationsbereich (10 mg/L) wurden beispielsweise über 90% des jeweiligen Metalls aus der Lösung von der Alge entfernt. Mit steigender Anfangskonzentration kommt es zur Sättigung der Metallbindungsstellen an den Algen und damit einem Abflachen der Adsorptionsisothermen. 0,5 qeq (mmol/g) 0,4 0,3 0,2 Cd Ni Pb Zn 0,1 0,0 0,0 Abb. 5–1: 0,5 1,0 1,5 ceq (mmol/L) 2,0 2,5 3,0 Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Die Adsorptionsisothermen in Abb. 5–1 lassen sich mit dem Adsorptionsmodell nach Langmuir (Gl. 2–1) beschreiben. Aus den in Abb. 5–1 dargestellten experimentellen Daten wurden 50 Ergebnisse die entsprechenden Langmuirparameter (Tab. 5–1) berechnet und die resultierende Isotherme ebenfalls als durchgehende Kurve in Abb. 5–1 für jedes Metall abgebildet. Die linearisierte Form (Gl. 2–2) dieser Adsorptionsisothermen wird in Abb. 5–2 für die Adsorptionsvorgänge an Chlorella vulgaris dargestellt. Eine sehr gute Korrelation zwischen den experimentellen Daten und dem Modell ist vor allem für Cd und Pb gegeben (r2 > 0,999). Zn zeigt mit r2 = 0,993 eine gute Korrelation und Ni mit r2 = 0,989 die schlechteste Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. 0,007 y = 0,0027x + 0,0005 2 r = 0,9931 0,006 ceq / qeq 0,005 y = 0,0033x + 6E-05 2 r = 0,9998 0,004 y = 0,0024x + 0,0005 2 r = 0,9888 0,003 y = 0,0021x + 6E-05 2 r = 0,9994 0,002 0,001 Cd Pb Ni Zn 0,000 0,0 Abb. 5–2: 0,5 1,0 1,5 ceq (mmol/L) 2,0 2,5 3,0 Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir Die aus den Regressionsgeraden berechneteten Werte für die maximale Beladungskapazität (qmax) und der Langmuirkonstanten (b) sind in Tab. 5–1 dargestellt. Tab. 5–1: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an C. vulgaris Metall qmaxa bb Cd 0,30 56 Ni 0,41 4,5 Pb 0,47 38 Zn 0,37 6,0 a b qmax in mmol/g Langmuirkonstante in L/mmol An C. vulgaris wurden maximale Beladungen nach Langmuir von 0,30 mmol Cd; 0,41 mmol Ni; 0,47 mmol Pb und 0,37 mmol Zn pro g BTM erreicht (Pb > Ni > Zn > Cd). Cd und Pb 51 Biosorptionsuntersuchungen zeigen eine deutlich größere Langmuirkonstante und damit höhere Affinität zur Alge verglichen mit Ni und Zn. Aus den Werten der Langmuirkonstante ergibt sich folgende Affinitätsreihenfolge: Cd > Pb > Zn >Ni. 5.1.1.2 Kinetik Die Darstellung der Kinetik der Biosorption der vier Metalle an C. vulgaris in Abb. 5–3 verdeutlicht, dass alle vier Metalle unter den gewählten experimentellen Bedingungen sehr schnell gebunden werden. Die Versuche zeigen, dass eine Zeit von weniger als 30 min zur Gleichgewichtseinstellung der vier Metalle ausreichend ist. Bereits nach 3 min waren über 91 % der Gleichgewichtsbeladung der entsprechenden Metalle erreicht. 1,0 Cd (0,2)* Ni (0,2) Pb (0,8) Zn (0,2) 40 60 80 100 ceq / c0 0,9 0,8 0,7 0,6 0 20 * c0 g/L Abb. 5–3: 120 Zeit (min) Kinetik der Metallbindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Die gewählten Ausgangskonzentrationen für die Untersuchungen liegen für alle Metalle im oberen Sättigungsbereich der Adsorptionsisothermen. 5.1.1.3 pH-Abhängigkeit Um den Einfluss des pH-Wertes auf die Biosorption an C. vulgaris einschätzen zu können, wurden die pH-Abhängigkeit näher untersucht (Abb. 5–4). Die Versuche wurden im pHBereich von 1 bis 6 durchgeführt. Der pH-Bereich oberhalb pH 6 wird wegen der beginnenden Fällung von Metallhydroxiden nicht weiter betrachtet. Im pH-Bereich von 4 bis 6 sind die Kapazitäten für Cd, Pb Zn und im pH-Bereich 5 bis 6 für Ni annähernd konstant. Die Konkur- 52 Ergebnisse renz der Protonen um die Bindungstellen reduziert die Beladungskapazitäten für die Metalle bei niedrigen pH-Werten. 0,5 qeq (mmol/g) 0,4 0,3 0,2 Cd (0,2)* Ni (0,2) Pb (0,8) 0,1 Zn (0,2) 0,0 1 * c0 g/L Abb. 5–4: 2 3 4 5 6 7 pH pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Ni, Pb und Zn an C. vulgaris Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Ein starker Abfall der Beladungskapazitäten konnte für Pb im pH-Bereich von 3 - 1; für Cd von 4 - 1,2; für Ni von 4,7 - 1,4 und für Zn von 4,3 - 1,6 beobachtet werden. Aufgrund der Konkurrenz der Protonen um die Bindungstellen ist es möglich, die Metalle mit 0,1 N Salzsäure zu über 90 % von C. vulgaris zu desorbieren. 5.1.2 Screening Die Eigenschaften von C. vulgaris wurden als Grundlage für die folgenden Untersuchungen weiterer Algenarten verwendet. Die Screeningexperimente wurden mit einer konstanten Anfangskonzentration für jedes Metall durchgeführt. Dazu wurde einheitlich für jedes Metall die Konzentration gewählt, bei der C. vulgaris gesättigt wurde. Daraus ergeben sich für die Batchversuche im Screening folgende Ausgangskonzentrationen: Blei 400 mg/L und Cadmium, Nickel und Zink jeweils 100 mg/L. 30 weitere Algenarten wurden untersucht (12 Arten der Chlorophyceae, 14 Arten der Cyanophyceae, jeweils 1 Art der Bacillariophyceae, Bangiophycea, Eustigmatophyceae und Xanthophyceae; Tab. 4–1). In Tab. 5–2 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Die Anfangskonzentration der einzelnen Metalle ist in Klammern dargestellt. 53 Biosorptionsuntersuchungen Tab. 5–2: Biosorptionseigenschaften im Screening von 31 Algenarten Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Pb (0,4)a Cd (0,1) Ni (0,1) Zn (0,1) Biomasse Ads.b qeqc Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq C. salina 100 0,89 98 0,38 49 0,37 94 0,64 S. hofmani 96 0,85 84 0,33 22 0,17 53 0,37 L. taylorii 97 0,84 81 0,32 56 0,43 50 0,37 A. densus 91 0,80 64 0,24 34 0,26 37 0,23 K. spiculiformis 84 0,71 86 0,34 41 0,28 63 0,42 V. dichotoma 83 0,70 70 0,28 49 0,37 67 0,42 C. kessleri 63 0,55 63 0,24 16 0,12 20 0,14 M. species 62 0,54 63 0,25 27 0,20 35 0,24 N. parmeloides 56 0,50 58 0,23 27 0,22 33 0,23 S. maxima 55 0,49 69 0,27 15 0,12 24 0,18 C. vulgaris 55 0,46 69 0,29 43 0,31 44 0,28 G. longicauda 51 0,44 67 0,27 27 0,20 36 0,25 R. spiculiforme 45 0,40 62 0,25 34 0,26 15 0,11 A. hantzschii 46 0,39 68 0,27 33 0,25 39 0,27 S. platensis 44 0,38 72 0,29 51 0,40 54 0,37 P. tricornutum 41 0,36 55 0,23 24 0,19 32 0,23 M. aeroginosa 40 0,35 59 0,23 27 0,21 36 0,25 P. purpureum 38 0,33 45 0,18 26 0,20 27 0,19 T. species 36 0,30 33 0,13 35 0,26 35 0,24 54 Ergebnisse Pb (0,4)a Cd (0,1) Ni (0,1) Zn (0,1) Biomasse Ads.b qeqc Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq G. verrucosa 28 0,24 37 0,15 17 0,13 24 0,16 C. species 26 0,23 48 0,20 22 0,17 14 0,10 A. cilindrica 25 0,22 36 0,14 18 0,14 16 0,11 S. laxissima 25 0,22 55 0,22 17 0,13 26 0,18 G. planctonica 21 0,21 15 0,06 14 0,11 14 0,07 S. species 22 0,19 61 0,24 13 0,09 53 0,36 P. species 22 0,19 43 0,17 23 0,18 16 0,11 A. africanum 22 0,18 43 0,17 19 0,15 27 0,17 E. magnus 19 0,16 22 0,09 16 0,12 8 0,06 D. salina 12 0,10 17 0,07 8 0,06 9 0,06 A. inaequealis 11 0,10 20 0,08 15 0,12 14 0,10 D. bioculata 3 0,02 11 0,05 7 0,05 6 0,04 a Anfangskonzentration der einzelnen Metalle in g/L Adsorptionseffizienz aus der Lösung in % c qeq in mmol/g b Bei den unterschiedlichen Arten von Mikroalgen wurden große Unterschiede bezüglich ihrer Biosorptionskapazitäten für die vier Metalle beobachtet. Blei wurde von den meisten Algen am stärksten adsorbiert. Die Chlorophyceae C. salina, die Cyanophyceae S. hofmani und L. taylorii erwiesen sich insgesamt als die leistungsfähigsten Algen im Screening. C. salina erreichte Beladungskapazitäten von 0,89 mmol Pb; 0,38 mmol Cd; 0,37 mmol Ni und 0,64 mmol Zn pro g BTM. Für Pb, Cd und Zn konnte die Alge die Metalle fast vollständig aus der Lösung entfernen (Adsorptionseffizienz ≥ 94 %). Die Beladungskapazitäten im Screening für S. hofmani betrugen 0,85 mmol Pb; 0,33 mmol Cd; 0,17 mmol Ni und 0,37 mmol Zn pro g BTM. L. taylorii zeigt Beladungen von 0,84 mmol Pb; 0,32 mmol Cd; 0,43 mmol Ni und 0,37 mmol Zn pro g BTM. S. hofmani und L. taylorii konnten Pb ebenfalls Biosorptionsuntersuchungen 55 praktisch komplett aus der Lösung entfernen (Adsorptionseffizienz ≥ 96 %). Cd und Ni wurde von beiden Algen zu über 80 % aus der Lösung gebunden. Die Kapazität von Ni für L. taylorii ist die größte von allen untersuchten Algen im Screening. Die Chlorophyceae K. spiculiformis und A. densus und die Xanthophyceae V. dichotoma zeigen ebenfalls gute Adsorptionsergebnisse für alle vier Metalle. K. spiculiformis und V. dichotoma besitzen eine beachtliche Kapazität für Zn mit jeweils 0,42 mmol Zn pro g BTM im Vergleich zu den untersuchten Algen. Bei den meisten weiteren Algen sinken mit der Kapazität für Blei auch die Kapazitäten für die anderen Metalle. S. platensis besitzt dagegen hervorragende Beladungskapazitäten für Ni (0,40 mmol/g BTM) und Zn (0,37 mmol/g BTM), die mit den besten Algen vergleichbar sind. Im Vergleich zu den leistungsfähigen Algen ist die Chlorophyceae D. bioculata nur in der Lage 3 % Blei, 11 % Cadmium, 7 % Nickel and 6 % Zink aus den vorgegebenen Lösungen zu binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Biosorptionseigenschaften der leistungsfähigen Algen C. salina und L. taylorii näher untersucht. 5.1.3 Biosorption von C. salina 5.1.3.1 Adsorptionsisothermen Zur Ermittlung der maximalen Kapazitäten von C. salina unter den gegebenen Bedingungen wurden analog zu C. vulgaris Adsorptionsisothermen aufgenommen. Die Adsorptionsisothermen der einzelnen Metalle an C. salina sind in Abb. 5–5 dargestellt. Die Adsorptionsisothermen lassen sich mit dem Adsorptionsmodell nach Langmuir (Gl. 2–1) beschreiben. Aus den in Abb. 5–5 dargestellten experimentellen Daten wurden die entsprechenden Langmuirparameter (Tab. 5–3) berechnet und die resultierende Isotherme ebenfalls als durchgehende Kurve in Abb. 5–5 für jedes Metall abgebildet. Die linearisierte Form (Gl. 2–2) dieser Adsorptionsisothermen wird in Abb. 5–6 für die Adsorptionsvorgänge an C. salina dargestellt. Eine sehr gute Korrelation zwischen den experimentellen Daten und dem Modell ist vor allem für Pb wiederum gegeben (r2 > 0,999). Cd und Zn zeigen mit einem r2 von 0,996 bzw. 0,997 eine gute Korrelation. Die Isotherme von Ni besitz mit r2 = 0,981 die schlechteste Übereinstimmung mit den experimentellen Daten, was ebenfalls bei C. vulgaris beobachtet werden konnte. 56 Ergebnisse 2,0 qeq (mmol/g) 1,6 Cd Ni Pb Zn 1,2 0,8 0,4 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–5: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 0,010 Cd Pb Zn y = 0,0017x + 0,0011 2 r = 0,9809 0,008 ceq / qeq Ni 0,006 y = 0,0011x + 0,0002 2 r = 0,9968 y = 0,0011x + 1E-04 2 r = 0,9962 0,004 0,002 y = 0,0005x - 7E-07 r2 = 0,9994 0,000 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–6: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir Die aus den Regressionsgeraden berechneteten Werte für die maximale Beladungskapazität (qmax) und der Langmuirkonstanten (b) sind in Tab. 5–3 dargestellt. An C. salina wurden maximale Beladungen nach Langmuir von 0,89 mmol Cd; 0,59 mmol Ni; 1,94 mmol Pb und 0,93 mmol Zn pro g BTM erreicht (Pb > Zn > Cd > Ni). 57 Biosorptionsuntersuchungen Pb zeigt eine sehr viel größere Langmuirkonstante und damit höhere Affinität zur Alge verglichen mit den anderen Metallen. Aus den Werten der Langmuirkonstante ergibt sich folgende Affinitätsreihenfolge: Pb > Cd > Zn > Ni. Tab. 5–3: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an C. salina Metall qmaxa bb Cd 0,89 12 Ni 0,59 1,6 Pb 1,94 707 Zn 0,93 5,8 a b qmax in mmol/g Langmuirkonstante in L/mmol 5.1.3.2 Kinetik Analog zu C. vulgaris zeigen die kinetischen Untersuchungen an C. salina (Abb. 5–7), dass bereits nach wenigen Minuten ein grossteil der Metalle gebunden sind. Die Biosorption der Metalle Pb, Cd und Zn ist nach 15 Minuten im Gleichgewicht. 1,0 0,9 Cd (0.4)* Ni (0.1) Pb (2) Zn (0.4) 80 100 Ceq / C0 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0 * c0 g/L Abb. 5–7: 20 40 60 120 Zeit (min) Kinetik der Metallbindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Eine Ausnahme stellt die Anlagerung von Ni an der Alge dar, wo über den gesamten Zeitraum eine leichte Zunahme der Beladung zu beobachten war. C. salina konnte nach 30 min 58 Ergebnisse im Mittel 46 % der vorgegeben Nickelmenge aus der Lösung entfernen, nach 120 Minuten waren 51 % der vorhandenen Nickelionen adsorbiert. 5.1.3.3 pH-Abhängigkeit Die Bedeutung des pH-Wertes für die Biosorption konnte bereits bei C. vulgaris gezeigt werden (Kap. 5.1.1.3). Das pH-Profil (pH/Metallbeladung) einer Alge stellt den Arbeitsbereich der Biosorption für die einzelnen Metalle dar. Für die Optimierung der Biosorption, als auch für eine Anwendung in realen Abwässern ist die Kenntnis der pH-Abhängigkeit sehr wichtig. Die pH-Abhängigkeit der Biosorption von C. salina gegenüber den 4 Metallen ist in Abb. 5–8 gezeigt. 2,0 1,6 qeq (mmol/g) Cd (0.4)* Ni (0.1) Pb (2) Zn (0.4) 1,2 0,8 0,4 0,0 1 * c0 g/L Abb. 5–8: 2 3 4 5 6 pH pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Wie bei C. vulgaris konnte auch bei C. salina ein pH-Bereich beobachtet werden, in dem die Beladungen sich nur geringfügig ändern. Im pH-Bereich von 3 bis 6 sind die Kapazitäten für Cd, Ni, Zn und ab pH 2 für Pb annähernd konstant. Bei höheren Protonenkonzentrationen nimmt die Konkurrenz um die Bindungsstellen zu, was in einem starken Abfall der Beladungen resultiert. Bei einem pH-Wert von nahe 1 sind die Beladungen nur noch ein Bruchteil von denen im schwach sauren Bereich, was die Möglichkeit der Desorption der Metalle im sauren pH-Bereich (pH 1) bietet. 59 Biosorptionsuntersuchungen 5.1.3.4 Selektivität der Bindung von Blei, Cadmium, Nickel und Zink Reale Abwässer stellen meist ein Gemisch vieler Metallkationen dar. Neben der Betrachtung der Kapazität des Biosorbens ist es deshalb ebenfalls wichtig zu untersuchen, ob einige Metallkationen bevorzugt gegenüber anderen von der Alge sorbiert werden können. Die Selektivität der Alge C. salina gegenüber den 4 bisher untersuchten Metallen wurde durch Versuche zur Konkurrenz der Metalle in äquimolaren Lösungen bestimmt. Die Tabelle Tab. 5–4 und die Abbildung Abb. 5–9 fassen die Untersuchungen zusammen. Tab. 5–4: Selektivität der Metallbindung an C. salina nMeb C0 4 Pba c Cd Ni Zn Σ qeq Ads.d qeqe Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq 0,5 99 0,23 70 0,16 21 0,05 72 0,16 0,60 1,0 100 0,48 45 0,26 9 0,05 53 0,25 1,04 2,0 100 1,00 26 0,29 3 0,03 26 0,24 1,56 3,0 100 1,30 23 0,30 4 0,04 11 0,14 1,78 a RSD (n=3) ≤ 3 % Pb, ≤ 8 % Cd; ≤ 17% Ni und ≤ 10 % Zn Anzahl der Metalle in Lösung c Anfangskonzentration der 4-Metall-Lösungen mit gleicher molarer Konzentration der einzelnen Metalle in mmol/L d Adsorptionseffizienz aus der Lösung in % e qeq in mmol/g b In direkter Konkurrenz aller 4 Metalle um die Bindungsstellen an C. salina konnte gezeigt werden, dass Pb bevorzugt gebunden wird. Wie Abb. 5–9 verdeutlicht, ist nur für Pb ein deutlicher Anstieg der Beladung bei ansteigender Metallkonzentration in der Lösung zu beobachten. Bei der höchsten Konzentration (3 mmol/L) hat die Alge Blei vollständig aus der Lösung entfernt. Cd und Zn sind bereits in der Sättigung. Die erreichten Beladungen für Cd und Zn sind deutlich niedriger im Vergleich zu den einzelnen Isothermen. Cd und Zn zeigen über den untersuchten Konzentrationsbereich einen ähnlichen Verlauf der Beladungen. Erst bei der höchsten Konzentration wird die Beladung von Zink deutlich geringer gegenüber Cadmium. Die Beladung von Cadmium ist konstant. 60 Ergebnisse Ni wird fast vollständig von den Bindungstellen an der Alge verdrängt. Die Beladung von Ni an C. salina betrug weniger als ein zehntel der maximalen Beladung an der Alge aus der Einstoffisotherme. 1,4 1,2 qeq (mmol/g) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 3 2 0,0 1 Pb Abb. 5–9: Cd Ni 0,5 c0 (mmol/L) Zn Konkurrenz der Bindung von Cd, Ni, Pb und Zn an C. salina. Die Versuche wurden mit 4-Metall-Lösungen (gleiche molare Konzentration der einzelnen Metalle) unterschiedlicher Anfangskonzentrationen (c0) durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Aus den ermittelten Daten lässt sich folgende Selektivitätsreihenfolge für eine Mischung der 4 Metalle ableiten: Pb >> Cd ≥ Zn >> Ni. 61 Biosorptionsuntersuchungen 5.1.4 Biosorption von L. taylorii Im folgenden sind die Ergebnisse zur Biosorption an der Cyanophyceae L. taylorii dargestellt. Die Untersuchungen stellen die umfangreichsten in dieser Arbeit dar, die an einer Algenart durchgeführt wurden. Die Alge konnte im Kooperationsprojekt erfolgreich für die Entwicklung eines Verfahrens zur Abwasserreinigung eingesetzt werden (Wilke, 2001). Weiterhin erfolgten an L. taylorii erfolgreich Modifizierungen, die zu einem neuen Biosorbens mit hervorragenden Biosorptionseigenschaften führte (Kap. 5.3). Die Frage nach der Biosorption von weiteren Schwermetallkationen an L. taylorii wurden im Verlauf des Projektes immer stärker gestellt, besonders nach der vielversprechenden Anwendung mit realen Abwässern. Im Rahmen einer Praktikantenarbeit konnten umfangreiche Daten zur Biosorption des industriell bedeutenden Metalls Kupfer (Cu) an L. taylorii erarbeitet werden. Die Ergebnisse werden im folgenden mit den anderen 4 Metallen beschrieben. 5.1.4.1 Adsorptionsisothermen – L. taylorii Die Adsorptionsisothermen (Einstoff) in Abb. 5–10 verdeutlichen, dass Pb auch an L. taylorii die höchsten Beladungen erreicht. 1,5 qeq (mmol/g) 1,2 Cd Cu Ni Pb Zn 0,9 0,6 0,3 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–10: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Der Verlauf der Isothermen von Pb, Cu, Zn und Cd sind ähnlich. Ni zeigt einen deutlich flacheren Verlauf. Die Langmuirparameter wurden aus den Geradengleichungen (Abb. 5–11) 62 Ergebnisse der nach Langmuir (Gl. 2–1 u. Gl. 2–2) linearisierten experimentellen Daten berechnet. Die daraus resultierenden Isothermen für die einzelnen Metalle sind in Abb. 5–10 eingezeichnet. Die Geraden in Abb. 5–11 zeigen eine gute Korrelation der experimentellen Daten mit dem Modell nach Langmuir mit einem r2 von 0,999 für Pb und Ni; 0,998 für Cd; 0,995 für Zn und 0,992 für Cu. 0,012 y = 0,002x + 0,0001 2 r = 0,9952 0,010 y = 0,0027x + 0,0002 r2 = 0,9978 ceq/qeq 0,008 y = 0,0015x + 0,0002 r2 = 0,9922 0,006 y = 0,0015x + 0,0012 r2 = 0,9987 0,004 0,002 Cu Ni y = 0,0007x + 5E-05 2 r = 0,9985 Cd Pb Zn 0,000 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–11: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir Die aus den Regressionsgeraden berechneten maximalen Beladungskapazitäten und Langmuirkonstanten sind in der folgenden Tabelle abgebildet (Tab. 5–5). Tab. 5–5: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an L. taylorii Metall qmaxa bb Cd 0,37 13 Cu 0,68 8,1 Ni 0,65 1,3 Pb 1,47 14 Zn 0,49 15 a b qmax in mmol/g Langmuirkonstante in L/mmol 63 Biosorptionsuntersuchungen Zusammengefasst lässt sich folgende Reihenfolge der maximalen Kapazitäten für die Metalle an der Alge aufstellen: Pb > Cu ≥ Ni > Zn > Cd. Die Affinitäten (Langmuirkonstante) für Cd, Cu, Pb und Zn gegenüber den Bindungstellen an der Alge sind in einer Größenordung (Affinitätsreihenfolge: Zn ≥ Pb ≥ Cd > Cu > Ni). Die Affinität von Ni beträgt etwa ein zehntel der von Zn. 5.1.4.2 Kinetik Der kinetische Verlauf der Biosorption an L. taylorii zeigt einen ähnlichen Verlauf verglichen mit C. vulgaris und C. salina. Die Kinetik des neu untersuchten Metalls Cu ist mit den anderen Metallen vergleichbar. Setzt man die Adsorption nach 120 min als 100%, so zeigt sich das nach 3 min bereits 81 % des vorhandenen Pb, 90 % Cd, 83 % Ni, 86% Zn und 95% des vorhandenen Cu adsorbiert waren. Der Biosorptionsprozess an der Alge ist nach 30 min praktisch vollständig abgeschlossen. Für Ni und Zn konnten bis zum Zeitpunkt 30 min ein deutlicher linearer Verlauf der Kinetik beobachtet werden. Die gewählten Ausgangskonzentrationen für die Untersuchungen liegen für alle Metalle im oberen Sättigungsbereich der Adsorptionsisothermen. 1,0 Cd (0,24)* Pb (0,8) c / c0 0,8 Cu (0,4) Ni (0,2) Zn (0,2) 0,6 0,4 0,2 0 * c0 g/L 20 40 60 80 100 120 Zeit (min) Abb. 5–12: Kinetik der Metallbindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. 64 Ergebnisse 5.1.4.3 pH-Abhängigkeit der Biosorption Das pH Profil von L. taylorii (Abb. 5–13) verdeutlicht, dass erneut ein pH-Bereich für alle fünf Metalle vorhanden ist, in dem sich die Beladungen nur geringfügig ändern. Diese Eigenschaft ist bedeutend, da in der Anwendung Schwankungen des pH-Wertes im Abwasser keine starken Schwankungen in der Beladung erwarten lassen. 1,5 Cd (0,1)* Cu (0,4) 1,2 qeq (mmol/g) Ni (0,1) Pb (0,6) 0,9 Zn (0,1) 0,6 0,3 0,0 1 2 * c0 g/L 3 4 5 6 7 pH Abb. 5–13: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Die Beladungen für Blei, Cadmium und Zink sind ab pH 3 bis pH 6, für Kupfer im Bereich ab pH 3 bis pH 5 und für Nickel ab pH 4 bis 6 annähernd konstant. Im sauren Bereich (pH < 3) nimmt die Biosorption für Pb, Cd, Ni und Zn stark ab. Eine Ausnahme stellt das Kupfer dar, das selbst bei pH 1 noch eine deutliche Beladungskapazität zeigt. Untersuchungen oberhalb pH 5 für Kupfer und oberhalb pH 7 für die anderen Metalle wurden wegen der einsetzenden Fällung von Metallhydroxiden nicht durchgeführt. Die starke Abnahme der Beladungskapazitäten im sauren pH-Bereich kann somit zur Desorption der Metalle einer beladenen Alge verwendet werden. Im Mittel konnten Pb, Cd, Ni oder Cu zu über 90 % von einer zuvor beladenen Algen im Batchversuch mit 0,1 N Salzsäure desorbiert werden. Aus dem pH Profil waren Probleme in der Desorption von Cu erwartet worden, die jedoch nicht beobachtet wurden. Zn konnte im Mittel nur zu 70 % von der Alge mit 0,1 N Salzsäure desorbiert werden. Biosorptionsuntersuchungen 5.1.4.4 65 Selektivität der Bindung von Blei, Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink Inwieweit Selektivitäten von L. taylorii für die Bindung der Metalle vorhanden sind, konnte durch Untersuchungen zur Konkurrenz der Metalle in äquimolaren Lösungen bestimmt werden. In Tab. 5–18 sind die Daten zu den Versuchen zusammengefasst dargestellt. Abb. 5–14 A-C verdeutlicht die Abhängigkeiten der einzelnen Metalle zueinander und dient der Übersichtlichkeit. Ausgehend von einer Mischung von Cd, Ni, Pb und Zn wurde untersucht, wie sich die Beladungen für die vier Metalle bei steigenden Metallkonzentrationen verhalten. Abb. 5–14 B zeigt deutlich, dass mit steigender Ausgangskonzentration von Pb, wie im Einzelversuch, die Beladung ebenfalls steigt. Die Beladungen von Ni und Zn verhalten sich über dem untersuchten Bereich annähernd konstant, jedoch sind die Beladungen auf sehr niedrigem Niveau. Mit steigender Anfangskonzentration der Metalle wird die Bindung von Cd im Gegensatz zum Pb immer stärker beeinflusst. Bei einer Anfangskonzentration von 3 mmol/L konnte eine Biosorption von Cd nicht mehr nachgewiesen werden. Die starke Verdrängung von Cd durch Pb bei höheren Anfangskonzentrationen konnte durch Versuche in einer Lösung von Cd und Pb bestätigt werden. Wie aus Tab. 5–6 ersichtlich, nimmt die Beladung von Cd rapide ab mit steigender Beladung von Blei. Die Selektivität in einer 4 Metalllösung lässt sich in folgender Reihenfolge zusammenfassen: Pb >> Zn > Ni > Cd. Wird Cu in die Betrachtung der Konkurrenz mit hinzugenommen, so zeigt sich, das Cu vom Blei nicht wie Cd, Ni und Zn so dominierend von den Bindungstellen verdrängt wird. Wie in Abb. 5–14 A dargestellt, werden Pb und Cu bevorzugt gebunden und erst bei einer Konzentration von 3 mmol/L verdrängt Pb deutlich das Cu von den Bindungsstellen. Cd und Ni werden wieder auf niedrigem Niveau gebunden und sind somit stark von Pb und Cu beeinflusst. Das trifft auch für Zn zu, jedoch konnte die Alge beim Konzentrationsniveau 0,5 mmol/L noch 79 % Zn aus der Lösung entfernen. Bei einer Anfangskonzentration der 5 Metalllösung von 1 mmol/L brach die Beladungskapazität von Zn stark ein. Die Alge adsorbierte nur noch 3 % des in der Lösung enthaltenen Zinks. Die Gesamtbeladung an den 5 Metallen auf der Alge ist vom Konzentrationsniveau 0,5 mmol/L auf 1 mmol/L annähernd konstant geblieben (s. Tab. 5–6). Ein großer Unterschied konnte jedoch in der Beladung von Pb beobachtet werden. Bei 0,5 mmol/L konnte die Alge das Pb fast vollständig aus der Lösung entfernen (97 %), wohingegen bei 1 mmol/L eine Sättigung der Bindungstellen beobachtet wurde (Adsorption Pb aus der Lösung 63 %). Für eine Lösung aus allen fünf Metallen lässt sich folgende Selektivität ableiten: Pb > Cu >> Cd > Ni >Zn. 66 Ergebnisse 0,42 A qeq [mmol/g] 0,35 0,28 0,21 0,14 0,07 n.n. n.n. 0,00 Pb B Cu Zn Cd Ni 0,5 1,0 2,0 3,0 c0 (mmol/L) 0,9 0,8 0,7 qeq (mmol/g) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 n.n. 0,1 0,0 Pb Cd Ni Zn 0,5 1 2 3 c0 (mmol/L) C qeq (mmol/g) 0,16 0,12 0,08 2 1 0,5 0,04 Cd Ni c0 (mmol/L) Zn Abb. 5–14: Konkurrenz der Bindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii Die Versuche wurden mit Mehrmetall-Lösungen (gleiche molare Konzentration der einzelnen Metalle) unterschiedlicher Anfangskonzentrationen (c0) durchgeführt. n.n. – Biosorption nicht nachweisbar. Parameter s. Kap. 4.4 67 Biosorptionsuntersuchungen Tab. 5–6: nMeb c0 5 Selektivität der Metallbindung an L. taylorii Pba c d Cu 0,5 97 Ni Zn Σ qeq Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq 0,23 74 0,14 14 0,03 11 0,02 79% 0,18 0,60 63 0,30 55 0,21 6 0,03 8 0,03 3% 0,01 0,58 2,0 36 0,32 42 0,34 3 0,02 2 0,02 3,0 29 0,41 20 0,22 1 0,02 0,5 99 0,22 39 0,09 25 0,06 37 0,08 0,45 1,0 97 0,43 14 0,06 10 0,05 23 0,10 0,64 2,0 88 0,78 3 0,04 6 0,05 12 0,11 0,98 3,0 3 qeq 1,0 4 Ads. e Cd 60 0,83 4 0,05 8 0,11 0,99 n.n. n.n. n.n. n.n.f 0,71 0,65 54 0,10 36 0,08 69 0,12 0,30 1,0 22 0,09 15 0,06 42 0,14 0,29 2,0 2 0,5 11 0,09 7 0,06 21 0,16 0,31 100 0,23 70 0,15 0,38 1,0 99 0,49 21 0,09 0,58 2,0 97 0,92 3 0,03 0,95 3,0 a 0,5 79 1,16 n.n. 1,16 RSD (n=3) ≤ 4 % Pb; ≤ 6 % Cu; ≤ 10 % Cd (außer nMe=5, c0=2,0 mmol/L, RSD = 28%, c0=3,0 mmol/L, RSD = 40%); ≤ 10 % Ni (außer nMe=5, c0=2,0 mmol/L, RSD = 40%) und ≤ 7 % Zn b Anzahl der Metalle in Lösung c Anfangskonzentration der Mehrmetalllösungen mit gleicher molarer Konzentration der einzelnen Metalle in mmol/L d Adsorptionseffizienz aus der Lösung in % e qeq in mmol/g f Biosorption nicht nachweisbar 68 Ergebnisse Bei L. taylorii ist die Konkurrenz der Metalle Cd, Ni und Zn um die Bindungsstellen in Gegenwart von Pb und Cu schwerer einzuschätzen. Deshalb wurden weitere Untersuchungen zur Selektivität der Metallbindung in Abwesenheit von Pb und Cu durchgeführt. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass bei L. taylorii auch zwischen diesen Metallen eine Konkurrenz zu beobachten ist (s. Abb. 5–14 C). Zn wird gegenüber Cd und Ni bevorzugt gebunden. Ni wird bei steigenden Konzentrationen der anderen Metalle am stärksten von den Bindungstellen verdrängt. Über den gewählten Anfangskonzentrationsbereich bleibt die Gesamtbeladung der Metalle auf der Alge annähernd konstant (s. Tab. 5–6). Die Selektivitätsreihe kann wie folgt aufgestellt werden: Zn > Cd > Ni. 5.1.4.5 Einfluss von Fremdsalzen auf die Biosorption an L. taylorii Mit der Anwendung der Cyanophyceae L. taylorii in einem technischen Verfahren, das zur Reinigung von Industrieabwässern entwickelt wurde, stellte sich die Frage nach der Bedeutung von ein- und zweiwertigen Fremdkationen für die Biosorption der untersuchten Schwermetalle. Für die Untersuchungen wurde das einwertige Natriumion (Natriumchlorid) und das zweiwertige Calciumion (Calciumchlorid) ausgewählt. In den Abbildungen Abb. 5– 15 und Abb. 5–16 sind die Ergebnisse grafisch dargestellt. Der untersuchte Konzentrationsbereich für die beiden Metallionen erstreckt sich zwischen 0,4 g/L bis 20 g/L. Die Schwermetallkonzentrationen in den Lösungen lagen im Sättigungsbereich der Alge (0,1 – 0,4 g/L). 0,9 Cd (0,1)* Ni (0,1) Zn (0,1) 0,8 qeq (mmol/g) 0,7 Cu (0,4) Pb (0,4) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 * c0 g/L 2 4 6 8 10 12 cNa (g/L) 14 16 18 20 Abb. 5–15: Einfluss von Natriumionen auf die Biosorption an L. taylorii Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. 69 Biosorptionsuntersuchungen Ein Einfluss von Na auf die Biosorption von Cu und Ni konnte nicht festgestellt werden (Abb. 5–15). Die Beladung von Cu blieb über den betrachteten Konzentrationsbereich annähernd konstant. Bei Ni konnte ein leichter Anstieg der Beladung beobachtet werden. Bis zu einer Konzentration an Na von 2 g/L ist die Beladung von Zn an L. taylorii unverändert. Die Beladung sinkt um 8 % bei Anwesenheit von 20 g/L an Na. Die Konkurrenz von Na ist besonders stark bei Pb vorhanden, wo bereits bei einer Konzentration von 0,4 g/L Na die Beladung um 18 % und bei 2 g/L Na auf 43 % der ursprünglichen Beladung sinkt. Ein weitere Erhöhung der Na-Gehalte verringert die Beladung nur noch geringfügig. Mit steigender Na Konzentration sinkt die Beladung von Cd um 60 % (bei 20 g/L Na). Bis zu 2 g/L Na in der Cd Lösung konnte nur eine geringe Abnahme der Beladung registriert werden. 0,9 Cd (0,1)* qeq (mmol/g) 0,7 Cu (0,4) Pb (0,4) 0,8 Ni (0,1) Zn (0,1) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 * c0 g/L 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 cCa (g/L) Abb. 5–16: Einfluss von Calciumionen auf die Biosorption an L. taylorii Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Der Einfluss von Ca demgegenüber ist deutlich größer (Abb. 5–16). Als Ausnahme muss hier das Cu benannt werden, wo wiederum keine signifikante Änderung der Beladungen bei steigenden Ca-Gehalten beobachtet werden konnte. Schon ein Gehalt von 0,4 g/L Ca in den Schwermetalllösungen führte zu einer Erniedrigung der Beladung von Cd um 40%, Ni um 42 %, Pb um 16% und Zn um 28%. Wird die Ca Konzentration weiter erhöht, so nehmen die Beladungen bis zu einer Ca Konzentration von 4 g/L ebenfalls ab und bleiben bei 18 g/L Ca in der Lösung annähernd konstant. Die Beladungen sinken bei 18 g/L Ca um 70% für Pb, 70 Ergebnisse 64% für Ni und 48% für Zn. Eine Beladung mit Cd war bei diesem Ca-Gehalt nicht mehr nachzuweisen. 5.1.4.6 Reinigung eines bleihaltigen Abwasser mit L. taylorii Die Entwicklung eines Verfahrens zur Abwasserreinigung auf Basis von L. taylorii wurde mit der Anwendung an einem realen Abwasser abgeschlossen. Dem Projektbereich wurde zu diesem Zweck von einem Akkumulatorenhersteller aus Berlin ein bleihaltiges Abwasser bereitgestellt. Angaben über die Zusammensetzung des Abwassers wurden von der Firma nicht gegeben. Somit erfolgte vor den eigentlichen Untersuchungen eine chemische Analyse des Abwassers. Die Summenparameter Leitfähigkeit (L), pH, TIC und TOC, sowie der Gehalt an Bor, Barium, Blei, Cadmium, Calzium, Eisen, Magnesium, Mangan, Ammonium, Nickel, Strontium, Vanadium, Zink, Nitrat, Nitrit und Sulfat wurden bestimmt und sind in Tab. 5–7 zusammenfassend dargestellt. Tab. 5–7: Chemische Zusammensetzung eines Abwassers aus der Akkumulatorenindustrie Parameter Messwert1) Parameter Messwert Parameter Messwert Pb (mg/L) 2,8 Cd (mg/L) 0,04 V (mg/L) <0,1 L (µS) 1700 Fe (mg/L) <0,1 Zn (mg/L) 1,21 pH 5,67 Mg (mg/L) 1,5 NO3 (mg/L) 3,6 TIC (mg/L) 92 Mn (mg/L) <0,1 NO2 (mg/L) 3,6 TOC (mg/L) n.n. Na (mg/L) <10 SO4 (mg/L) 847 B (mg/L) 0,2 NH4 (mg/L) 0,1 Ba (mg/L) <0,1 Ni (mg/L) 0,05 Ca (mg/L) 793 Sr (mg/L) 0,9 1) 2) Messbedingungen s. Kap. 4.4.2.5. n.n. – nicht nachweisbar Der Bleigehalt des Abwasser betrug 2,8 mg/L. Als mengenmäßig bedeutenste Ionen in der Lösung konnten Ca und Sulfationen analysiert werden. Wie in Kap. 5.1.4.5 gezeigt, konkurrieren Ca Ionen mit Pb um die Bindungstellen an L. taylorii. In der Größenordnung vom Blei konnten die Metalle Magnesium, Strontium und Zink bestimmt werden. Biosorptionsuntersuchungen 71 Vor dem Einsatz des Abwassers bei den Biotechnologen wurde untersucht, ob das vorhandene Blei bei Anwesenheit einer Vielzahl von Konkurrenzionen von der Alge im Batchversuch gebunden werden kann. Die Untersuchungen erfolgten unter Standardbedingungen (s. Kap. 4.4.2). Nach 30 Minuten war die Konzentration der Pb Ionen von 2,8 mg/L auf 0,3 mg/L gesunken. 89 % der vorhanden Pb Ionen im Abwasser wurde von der Alge gebunden. L. taylorii war somit in der Lage aus einem komplexen Abwasser das Schwermetall zu entfernen und die Reinigung des Abwassers mit einer Festbettkolonne, die mit immobilisierter L. taylorii gefüllt war, konnte erwartungsvoll im Kooperationsprojekt begonnen werden (Wilke, 2001). 5.1.5 Vergleichssorbenzien Im Verlauf der Arbeit wurden dem Projekt verschiedene Sorbenzien zur Verfügung gestellt, um die Leistungsfähigkeit mit anderen biologischen Materialien als auch mit neuen Ionenaustauschern zu vergleichen. Vom Institut für Biotechnologie der TU Berlin wurden uns für Vergleichszwecke zwei Polysaccharide aus der Fermentation (Glucaferm und Klo-235) und das Polysaccharid Chitosan überlassen. Als Vertreter neuer Kationenaustauscher wurde von der Firma Baker das Austauscherharz DW 22 und von der Firma Eisu ein Kationenaustauscher auf Holzbasis (Carbion) bereitgestellt. Detaillierte Informationen über die Herstellung der beiden Ionenaustauscher war von den Firmen nur schwer zu beziehen. DW 22 ist ein Austauscher auf Basis von Thiolgruppen. Carbion wurde auf Basis modifizierter Holzabfälle (Einbau von funktionellen Gruppen in die Cellulosematrix) entwickelt. 5.1.5.1 Screening Analog zur den Versuchen mit Algen erfolgte ein Screening unter den Standardbedingungen. In Tab. 5–8 sind die erzielten Ergebnisse zusammengefasst und mittels Abb. 5–17 ist ein direkter Vergleich mit den beiden leistungsfähigen Algen C. salina und L. taylorii möglich. DW 22 und Carbion zeigen hervorragende Eigenschaften unter den Screeningbedingungen und konnten die vier Metalle jeweils vollständig aus den Lösungen entfernen. Vor allem die Kapazitäten für Ni sind im Vergleich mit den C. salina und L. taylorii hervorzuheben. Glucaferm zeigt gute Beladungen für Pb und Cd, jedoch deutlich geringere für Ni und Zn. Klo-235 konnte nur 11 bis 13 % der Metalle aus der Lösung binden. Eine Sorption von Pb, Ni und Zn an Chitosan wurde nicht nachgewiesen. Chitosan konnte jedoch 24 % der Cd Ionen aus der Lösung entfernen. 72 Ergebnisse Tab. 5–8: Kapazitäten für Cd, Pb, Ni und Zn an Vergleichssorbenzien Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Pb (0,4)a Cd (0,1) Ni (0,1) Zn (0,1) Sorbens qeqc Ads.b Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq DW 22 100 0,87 100 0,42 99 0,77 99 0,67 Carbion 99 0,86 99 0,40 99 0,76 98 0,68 Glucaferm 73 0,64 56 0,22 4 0,03 24 0,17 Klo-235 12 0,10 13 0,05 13 0,10 11 0,08 24 0,10 Chitosan n.n. n.n. n.n. a Anfangskonzentration der einzelnen Metalle in g/L Adsorptionseffizienz aus der Lösung in % c qeq in mmol/g b 0,9 0,8 qeq (mmol/g) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,0 Pb (400 mg/L) C. salina L. taylorii Cd (100 mg/L) DW 22 Carbion Ni (100 mg/L) Glucaferm n.n. n.n. 0,1 n.n. 0,2 Zn (100 mg/L) Klo-235 Chitosan Abb. 5–17: Kapazitäten der Sorbenzien im Verhältnis zu C. salina und L. taylorii Die volle Leistungsfähigkeit der beiden Ionenaustauscher und damit der direkte Vergleich mit den Algen wurde durch Aufnahme der entsprechenden Isothermen eingeschätzt. Die folgenden Kapitel beschreiben die Adsorptionsisothermen an DW 22 und Carbion. 73 Biosorptionsuntersuchungen 5.1.5.2 Dowex 22 Analog zu den Algen wurde durch Variation der Anfangskonzentration der einzelnen Metalle in der Lösung die entsprechenden Einstoffisothermen an DW 22 ermittelt. Abb. 5–18 stellt die einzelnen Datenpunkte und die mit dem Modell nach Langmuir (Gl. 2–1 u. Gl. 2–2) ermittelten Isothermen (durchgehende Linie) dar. 1,2 qeq (mmol/g) 1,0 0,8 Cd 0,6 Ni Pb Zn 0,4 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 ceq (mmol/L) 3,5 4,0 4,5 5,0 Abb. 5–18: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an Dowex 22 Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Die Isothermen verdeutlichen, dass deren Verlauf und die maximalen Kapazitäten für die vier Metalle sehr ähnlich sind. Die einzelnen Parameter der Langmuirisothermen (Tab. 5–9) unterstreichen diese Beobachtung. Im Unterschied zu den Algen konnte eine Dominanz von Pb hinsichtlich der Kapazitäten nicht beobachtet werden. In der Affinität (Konstante b) zur Oberfläche zeigen sich aber Unterschiede. Tab. 5–9: Langmuirparameter für die Adsorptionsiosthermen an Dowex 22 Metall qmaxa bb r2 Cd 1,18 110,28 0,9999 Ni 1,16 48,00 0,9994 Pb 1,13 401,27 0,9996 Zn 1,21 75,11 0,9999 a b qmax in mmol/g Langmuirkonstante in L/mmol 74 Ergebnisse Aus den Daten der Langmuirkonstanten b ergibt sich folgende Affinitätsreihenfolge: Pb >Cd > Zn > Ni. Wie auch bei den Algen hat Ni die kleinste Affinität zum Sorbens. Die besonderen Beladungseigenschaften von C. salina und L. taylorii gegenüber Pb ergeben eine höhere Beladungskapazität für dieses Metall im Vergleich zum Ionenaustauscher. Für die anderen Metalle zeigt der Ionenaustauscher deutlich höhere Beladungen. Eine vollständige Desorption der Metalle vom DW 22 war erst mit einer Salzsäurelösung von > 1 mol/L möglich. 5.1.5.3 Carbion Der einzige kommerziell erhältliche Ionenaustauscher auf Basis von Abfallbiomasse (Holzspäne) in Deutschland ist Carbion. Nach Angabe des Herstellers wurde durch Einführung von funktionellen Gruppen in das Cellulosegerüst der Holzspäne ein leistungsfähiger Ionenaustauscher entwickelt. Die Adsorptionsisothermen nach Langmuir für Cd, Ni, Pb und Zn in Abb. 5–19 zeigen, dass die erzielten Beladungskapazitäten für die einzelnen Metalle die höchsten bisher gemessenen darstellen. 2,8 2,4 qeq (mmol/g) 2,0 1,6 1,2 Cd 0,8 Ni Pb Zn 0,4 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–19: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Ni, Pb und Zn an Carbion Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Die Kapazität für Pb ist wie bei den Algen deutlich größer im Verhältnis zu den anderen Metallen. Die maximale Beladung nach Langmuir (Tab. 5–10) für Pb beträgt 2,6 mmol/g. Die maximalen Beladungen für Cd, Ni und Zn liegen im Bereich von 1,7 – 1,9 mmol/g. Ni zeigt wiederum die geringste Affinität zur Oberfläche. 75 Biosorptionsuntersuchungen Tab. 5–10: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an Carbion Metall qmaxa bb r2 Cd 1,65 45,51 0,9998 Ni 1,77 7,39 0,9996 Pb 2,58 10,11 0,9996 Zn 1,88 7,66 0,9996 a b qmax in mmol/g Langmuirkonstante in L/mmol Die Metalle konnten mit einer 0,1 N Salzsäurelösung nicht vom Carbion desorbiert werden. Versuche mit einer 3 N Salzsäurelösung zeigten, dass 62 % des gebundenen Pb, 91 % Cd, 85 % Ni und 11 % Zn desorbiert werden konnten. 76 Ergebnisse 5.2 Charakterisierung der Bindungsstellen Ausgehend von Arbeiten von Crist et al. (1992, 1994, 1999), die die Bedeutung von funktionellen Gruppen für die Biosorption von Schwermetallen an Algen zeigten, wurden die Bindungstellen auf der Oberfläche der Algen charakterisiert. Träger der funktionellen Gruppen (z.B. Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfonsäure- und Aminogruppen) in der Zellwand der Algen sind vor allem Polysaccharide und in diese eingebettete Proteine. 5.2.1 Elementaranalyse der Biosorbenzien Zur Abschätzung der Gehalte an funktionellen Gruppen, die sich aus den Heteroatomen N, S und P zusammensetzen, wurde eine Elementaranalyse der im Screening eingesetzten Algen und der Vergleichssorbenzien durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 5–11 und Tab. 5–12 zusammengefasst. Die experimentellen Bedingungen sind in Kap. 4.5.1 erläutert. Die Daten in Tab. 5–11 wurden nach der Biosorptionsleistung der im Screening eingesetzten Algen sortiert (C. salina bis D. bioculata). Tab. 5–11: Elementaranalyse (C, H, N, S und P) der Algen Spezies Elementgehalte % a ∑ C H N S P C. salina 46 6,7 6,1 0,82 1,6 S. hofmani 40 6,3 5,9 0,19 L. taylorii 40 6,1 6,0 A. densus 43 6,4 K. spiculiformis 41 V. dichotoma molarer Gehalt mmol / g Biomasse N S P 61 4,3 0,26 0,52 3,4 56 4,2 0,06 1,1 0,30 1,5 54 4,3 0,09 0,47 6,5 0,44 3,5 60 4,7 0,14 1,1 5,8 10,0 0,76 1,8 59 7,2 0,24 0,57 44 5,7 3,7 0,89 0,72 55 2,6 0,28 0,23 C. kessleri 47 6,7 6,9 0,38 2,0 63 4,9 0,12 0,65 M. spezies 46 6,3 10,8 0,77 1,7 66 7,7 0,24 0,56 S. maxima 49 7,9 10,8 0,54 1,8 70 7,7 0,17 0,57 C. vulgaris 46 6,6 7,4 0,64 1,6 62 5,3 0,20 0,51 G. longicauda 44 6,6 6,4 0,18 1,4 58 4,5 0,05 0,46 R. spiculiforme 49 7,4 10,5 0,69 2,8 71 7,5 0,22 0,90 77 Charakterisierung der Bindungsstellen Spezies Elementgehalte % a ∑ C H N S P A. hantzschii 40 6,0 5,1 0,74 1,1 S. platensis 50 6,9 10,8 0,58 P. tricornutum 55 7,7 4,6 M. aeroginosa 49 7,0 P. purpureum 43 G. verrucosa molarer Gehalt mmol / g Biomasse N S P 53 3,6 0,23 0,36 2,1 70 7,7 0,18 0,68 0,92 1,5 69 3,2 0,29 0,49 6,6 0,76 1,6 65 4,7 0,24 0,51 6,7 2,4 0,99 1,6 55 1,7 0,31 0,53 50 7,3 1,8 0,14 2,0 61 1,3 0,04 0,64 C. spezies 49 7,3 4,9 0,76 1,5 63 3,5 0,24 0,49 A. cylindrica 49 6,9 9,3 0,46 1,9 68 6,6 0,14 0,62 S. laxissima 52 7,3 11,9 0,65 1,6 73 8,5 0,20 0,52 G. planctonica 50 7,7 3,1 0,32 1,2 62 2,2 0,10 0,39 S. spezies 38 5,8 7,9 0,36 2,3 54 5,7 0,11 0,73 P. spezies 44 6,5 5,9 0,27 1,9 58 4,2 0,08 0,62 A.africanum 46 6,8 7,9 0,37 2,1 63 5,6 0,12 0,68 E. magnus 59 8,7 2,0 0,19 1,6 71 1,4 0,06 0,51 D. salina 47 7,1 6,6 0,26 2,5 64 4,7 0,08 0,79 A. inaequealis 47 7,1 4,9 0,15 2,3 61 3,5 0,05 0,76 D. bioculata 47 6,6 1,6 0,07 1,5 57 1,1 0,02 0,50 a N. parmeloides und T. spezies wurden nicht untersucht. Die untersuchten fünf Elemente stellen 53 bis 73 % der Algenbiomasse dar. Das Element Sauerstoff wird zum großen Teil den verbleibenden Rest einnehmen. Erwartungsgemäß ist der C-Gehalt der Biomasse mit 38 bis 59 % am größten. Der H-Gehalt wurde von 6 bis 9 % bestimmt. Unter den Heteroatomen stellt N mit einem Gehalt von 2 bis 11 % (1 - 8 mmol/g Alge) das wichtigste Element, gefolgt von P mit einem Gehalt von 1 bis 3,5 % (0,2 – 1 mmol/g Alge) dar. Der S-Gehalt liegt in einem Bereich von 0,1 bis 1 % (0,02 – 0,3 mmol/g Alge). 78 Ergebnisse Bei Betrachtung der Heteroatome N, S und P lässt sich kein direkter Zusammenhang mit den unterschiedlichen Beladungskapazitäten der einzelnen Algen erkennen. So zeigen die Chlorophyceae R. spiculiforme, die Cyanophyceae S. platensis und die Cyanophyceae M. spezies die höchsten Gehalte an den Elementen N, S und P. C. salina befindet sich nach ihrem Gehalt an N, S und P auf Rang 13 der untersuchten Algen. L. taylorii zeigt eine noch geringeren Gehalt an Heteroatomen als C. salina und reiht sich auf Rang 24 aller untersuchten Algen ein. Funktionelle Gruppen aus diesen Heteroatomen spielen bei der Biosorption der betrachteten Metalle an den beiden Algen somit nur eine untergeordnete Rolle. Die Ergebnisse der Vergleichssorbenzien in Tab. 5–12 zeigen einen deutlichen Zusammenhang zwischen den Gehalten an P bzw. S in den kommerziellen Ionenaustauschern Carbion bzw. DW 22. Carbion weist einen P-Gehalt von 10 % (3,3 mmol/g Sorbens) auf, was auf eine Phosphorylierung der Holzmatrix schließen lässt. Verfahren zur Phosphorylierung von Holz sind in der Literatur als sehr erfolgreich beschrieben worden (s. Kap. 2.3.2.1). Der Ionenaustauscher DW 22 besitzt erwartungsgemäß einen sehr hohen S-Gehalt von 37 % (11,5 mmol/g Sorbens), da laut Herstellerangaben endständige Thiolgruppen für den Ionenaustausch verantwortlich sind. Tab. 5–12: Elementaranalyse (C, H, N, S und P) der Vergleichssorbenzien Elementgehalte % Spezies ∑ C H N S P Carbion 32,5 5,5 6,2 0,05 10,1 DW 22 32,8 3,4 0,2 37,0 Glucaferm 43,2 6,4 1,0 Klo-235 41,2 6,6 Chitosan 41,6 6,6 Molarer Gehalte mmol / g Sorbens N S P 54,3 4,4 0,01 3,3 1,6 75,0 0,2 11,5 0,5 0,04 1,2 51,8 0,7 0,01 0,4 8,0 < 0,02 1,3 57,1 5,7 - 0,4 5,6 < 0,02 1,2 55,1 4,0 - 0,4 Die drei biologischen Materialien zeigten keine Besonderheiten und waren bis auf ihren NGehalt sehr ähnlich. Der S-Gehalt war wie bei den Algen sehr gering. 79 Charakterisierung der Bindungsstellen 5.2.2 Bedeutung von Carboxylgruppen für die Biosorption Der in der Literatur angedeutete große Einfluss der Carboxylgruppe auf die Biosorption von Metallen aus wässrigen Lösungen wurde im folgenden an ausgewählten Algen untersucht. Die freien Carboxylgruppen der Algen wurden nach einer Methode von Gardea-Torresday et al. (1990) durch eine 48stündige Methylierung blockiert. Die Methylierung erfolgte in salzsaurem Methanol bei Raumtemperatur. Details zu der verwendeten Methode sind in Kap. 4.5.2 beschrieben. Für die Untersuchungen wurden sechs Algenarten mit verschiedenen Biosorptionseigenschaften ausgewählt. Abb. 5–20 stellt die Ergebnisse der Adsorptionsversuche an den modifizierten Algen im Vergleich zu den unbehandelten Algen dar. Auf der Y-Achse ist der Quotient aus der Aufnahmekapazität der modifizierten Alge zur unbehandelten Alge für die vier Metalle aufgetragen. Auf der X-Achse sind die einzelnen Metalle und in Klammern die Anfangskonzentration der jeweiligen Metalllösung dargestellt. 0,4 qeq, mod / qeq, 0 0,3 0,2 n.n. n.n. 0,1 0,0 Pb (0,4 g/L) C. salina C. spezies Cd (0,1 g/L) C.vulgaris Ni (0,1 g/L) L. taylorii S. platensis Zn (0,1 g/L) V. dichotoma Abb. 5–20: Einfluss einer Methylierung der Carboxylgruppen auf die Biosorption Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 (für V. dichotoma wurden die Beladung nur für Ni und Zn bestimmt); qeq, mod – Beladung der modifizierten Alge, qeq, 0 - Beladung der unbehandelten Alge, n.n. – Beladung nicht nachweisbar Die modifizierten Algen zeigten eine deutlich verringerte Adsorptionsfähigkeit für die Metalle. Die Beladungskapazität von C. salina verringert sich um über 90 % für Pb, Cd und Zn und um 80 % für Ni. Die Chlorophyceae C. spezies zeigte verringerte Beladungen im Bereich von 80 bis 86 % für die Metalle. Die Kapazitäten von C. vulgaris verringerten sich um 90 %. 80 Ergebnisse L. taylorii verlor nach der Methylierung 90 % seiner Kapazität für Pb, über 70 % für Cd und Ni und über 80 % für Zn. An der Cyanophyceae S. platensis konnte unter den gewählten Bedingungen nach der Methylierung für Nickel und Zink eine Adsorption nicht mehr nachgewiesen werden. An V. dichotoma konnte eine Erniedrigung um 66 % für Ni und 63 % für Zn beobachtet werden. Um den Nachweis zu erbringen, dass die Methylierung erfolgreich war und um eine quantitative Abschätzung der blockierten Carboxylgruppen zu erhalten, wurde nach der Hydrolyse der Algen das freigesetzte Methanol bestimmt. Details zu der verwendeten Methode sind in Kap. 4.5.2 angegeben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (Tab. 5–13) zusammengefasst. Tab. 5–13: Gehalt an Carboxylgruppen in den unbehandelten und behandelten Algen unbehandelta methylierta, b cMethanol (mmol / g) cMethanol (mmol / g) C. salina 0,03 0,80 C. spezies 0,03 0,34 C. vulgaris 0,03 0,81 L. taylorii 0,02 0,90 S. platensis 0,01 0,81 V. dichotoma 0,02 0,52 Spezies a b Versuchsdurchführung und –bedingungen s. Kap. 4.5.2.2 RSD (n≥4) ≤ 9 % Die Hydrolyse von unbehandelten Algen als Kontrollversuche ergab, daß in den Algen die Carboxylgruppen weitgehend frei vorliegen. Der Veresterungsgrad der nartürlichen Algen ist nur gering. Die methylierten Algen ergaben Gehalte an Methanol nach der Hydrolyse von 0,3 bis 0,9 mmol/g Alge. Die gefundenen Methanolgehalte entsprechen einem Carboxylgruppengehalt von 0,3 bis 0,9 mmol/g Alge. Diese Ergebnisse korrelieren mit den Biosorptionsversuchen an den methylierten Algen und zeigen, dass Carboxylgruppen an der Biosorption entscheidend beteiligt sind. Die höchsten Carboxylgruppengehalte wurden bei L. taylorii, C. salina, C. vulgaris und S. platensis gefunden und zeigen, daß noch andere wichtige Faktoren einen Beitrag zur Biosorption leisten. Die Biosorptionseigenschaften von den beiden leistungsfähigsten Algen unterscheiden sich deutlich von C. vulgaris und S. platensis. 81 Charakterisierung der Bindungsstellen 5.2.3 Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung der Zellwände Die vorhergehenden Untersuchungen zeigten die Bedeutung der Carboxylgruppen bei der Biosorption der vier Schwermetalle an ausgewählten Algen. Es ist bekannt, daß ein großer Teil der Carboxylgruppen in den Zellwandpolysacchariden der Algen lokalisiert sind (s. Kap. 2.2.3). Die sogenannten Uronsäuren (z.B. Galacturonsäure und Glucuronsäure) sind die monomeren Bestandteile dieser sauren Polysaccharide. Zur weiteren Charakterisierung der Bindungstellen wurden die Polysaccharide der Zellwand ausgewählter Algen nach saurer Hydrolyse auf ihre Monosaccharidzusammensetzung untersucht. Die untersuchten Algen wurden dafür wiederum hinsichtlich unterschiedlicher Biosorptionseigenschaften ausgesucht. Für die Bestimmung der freigesetzten Monosaccharide wurde eine HPLC-Methode an Anionenaustauschersäulen mit pulsamperometrischer Dektektion (HPAEC-PAD) an einer Goldelektrode etabliert. Die Methode ermöglicht die Trennung von Monosaccharid- bis Oligosaccharidgemischen. Die gleichzeitige Bestimmung der besonders interessierender Uronsäuren ist in einer Analyse zusammen mit den neutralen Monosacchariden möglich. Details zu der Methode und HPAEC-Chromatogramme sind in Kap. 4.5.3 im Experimentellen Teil dargestellt. In Tab. 5–14 sind die Ergebnisse der Untersuchungen der Zellwandpolysaccharide von sieben Algen zusammengefasst. Tab. 5–14: Monosaccharidzusammensetzung der Zellwände ausgewählter Algen Monosaccharidgehalt (% Alge) Anteil der hydrolysierbaren Monosaccharide (% bezogen auf Gesamtgehalt)a Spezies Gesamt Uronsäuren Ado Fuc Rha Gal Glc Man GaU GlU C. salina 12 1,1 0,7 1,0 1,7 21,2 51,1 15,1 8,7 0,6 L. taylorii 34 1,9 1,2 0,6 1,8 4,9 78,9 7,0 5,2 0,4 S. platensis 21 2,2 - 9,3 1,4 - 78,8 - 8,1 2,4 P. purpureum 74 4,2 2,0 0,6 - 8,5 68,5 14,8 1,3 4,4 G. verrucosa 23 0,2 3,1 0,2 27,4 15,1 32,8 20,5 0,7 0,2 C. spezies 34 1,0 5,3 1,4 - 4,5 76,2 9,4 1,7 1,4 E. magnus 22 0,8 22,4 13,1 7,6 - 53,1 - 2,5 1,3 a Ado = Adonitol; Fuc = Fucose; Rha = Rhamnose; Gal = Galactose; Glc = Glucose; Man = Mannose; GaU = Galacturonsäure; GlU = Glucuronsäure 82 Ergebnisse Die Gesamtgehalte an hydrolysierbaren Monosacchariden lagen in einem Bereich von 12 % bei C. salina und 74 % bei P. purpureum. Die Bestimmung der Uronsäuren ergab Gehalte im Bereich von 0,2 % (0,01 mmol/g Alge) bei G. verrucosa bis 4,2 % bei P. purpureum (0,2 mmol/g Alge). Als neutrale Komponenten der hydrolysierten Polysaccharide wurden Glucose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose und Adonitol gefunden. Glucose, Galactose und Mannose stellen die mengenmäßig wichtigsten Kohlenhydrate in den Hydrolysaten von C. salina, L. taylorii, P. purpureum, G. verrucosa (zusätzlich noch Rhamnose) und C. spezies dar. Das Hydrolysat der Cyanophyceae S. platensis setzt sich zu 79 % aus Glucose zusammen. Die Hauptmonosaccharide, die bei der Untersuchung von E. magnus bestimmt werden konnten, waren Glucose, Adonitol und Fucose. Die Uronsäuren Galacturon- und Glucuronsäure konnten in allen Hydrolysaten bestimmt werden. Mit Ausnahme von P. purpureum waren die Galacturonsäuregehalte höher als die Glucuronsäuregehalte. Der Anteil der Uronsäuren an dem Gesamtkohlenhydratgehalt der Algenhydrolysate betrug unter 9 % für Galacturonsäure und unter 5 % für die Glucuronsäure. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung, vor allem mit dem Anteil an Uronsäuren, und den unterschiedlichen Biosorptionskapazitäten war nicht zu erkennen. 5.2.4 Extraktion verschiedener Zellwandbestandteile Um die Bedeutung der Zellwandkomponenten im Biosorptionsprozess weiter zu untersuchen, wurden verschiedene Extraktionen angewendet. An C. salina und L. taylorii wurden lipophile, hydrophile und alkalische Extraktionen durchgeführt. Die Durchführung der Extraktionen ist in Kap. 4.5.4 detailliert beschrieben. In Abb. 5–21 und Abb. 5–22 sind die Auswirkungen der Extraktionen auf die Biosorptionseigenschaften an C. salina und L. taylorii für Blei und Zink zusammengefasst. Der Rückstand der lipophil extrahierten C. salina weist eine leicht höhere Beladung auf als die ursprüngliche Biomasse. Eine hydrophile oder alkalische Extraktion führte bei C. salina zu einer Erniedrigung der Beladung für Pb des erhaltenen Rückstandes. Die Beladung für Zn steigt nach lipophiler und alkalischer Extraktion an und verringert sich nach hydrophiler Extraktion (100 °C). Eine Beurteilung der Bedeutung der extrahierten Zellwandbestandteile wird erst durch Bezug der Beladung auf die ursprüngliche Biomasse möglich (Abb. 5–21B). Die Charakterisierung der Bindungsstellen 83 Extraktionen bewirken eine Aufkonzentrierung der verbleibenden Bindungstellen auf der Alge, was zu einer Erhöhung der Beladungen führen kann. A 1,4 1,2 qeq, mod / qeq, 0 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Blei (1,2 g/L) Zink (0,2 g/L) Blei (1,2 g/L) Zink (0,2 g/L) B 1,0 qeq, urspr. Biomasse / qeq, 0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Original (100%) Lipophil (65%) Alkalisch (42%) Hydrophil-100°C (78%) Abb. 5–21: Einfluss verschiedener Extraktionen auf die Biosorption an C. salina A - Beladung bezogen auf Rückstand; B - Beladung bezogen auf ursprüngliche Biomasse (qeq, mod – Beladung der modifizierten Alge, qeq, urpr. Biomasse – Beladung der modifizierten Alge bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Biomasse, qeq, 0 - Beladung der unbehandelten Alge, ( ) in der Legende – verbleibende Biomasse nach Extraktion) Ein Bezug der Beladungen auf die ursprüngliche Biomasse (Abb. 5–21B) zeigt, dass durch alle drei Extraktionen Bindungstellen für die beiden Metalle extrahiert wurden. Durch die alkalische Extraktion, mit der 58 % der Algenbiomasse extrahiert werden konnte, verringert sich die Beladung für Pb um über 65 % und für Zn um 48 %. Es konnte eine stärkere Beinflussung der Biosorption von Pb gegenüber Zn beobachtet werden. Die lipophile Extraktion ergab eine geringere Abnahme der Biosorptionsleistung von Pb um 26 % und Zn um 23 %. Eine wässrige Extraktion bei 100 °C führte zu einem Verlust von 22 % der Biomasse und eine deutliche Abnahme der Beladungen. Die Beladungen der Rückstände bei C. salina zei- 84 Ergebnisse gen, dass ein Großteil der Bindungsstellen in dem nicht extrahierbaren Zellwandgerüst lokalisiert sind. Diese Beobachtung zeigt sich bei den Ergebnissen der Extraktionen an L. taylorii noch verstärkt. Die verbleibende Biomasse zeigte nach den einzelnen Extraktionen höhere Beladungen als die unbehandelten Algen (Abb. 5–22A). A 2,1 1,8 qeq, mod / qeq, 0 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0,0 Pb (0,8 g/L) Zink (0,2 g/L) B 1,6 qeq, urspr. Biomasse / qeq, 0 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Pb (0,8 g/L) Original (100%) Lipophil (83%) Zink (0,2 g/L) Alkalisch (40 %) Hydrophil-100°C (56 %) Abb. 5–22: Einfluss verschiedener Extraktionen auf die Biosorption an L. taylorii A - Beladung bezogen auf Rückstand; B - Beladung bezogen auf ursprüngliche Biomasse (qeq, mod – Beladung der modifizierten Alge, qeq, urpr. Biomasse – Beladung der modifizierten Alge bezogen auf die ursprünglich eingesetzte Biomasse, qeq, 0 - Beladung der unbehandelten Alge, ( ) in der Legende – verbleibende Biomasse nach Extraktion) Um Aussagen über die Bedeutung der extrahierten Zellwandbestandteile für die Biosorption zu erhalten, wurde wiederum die Beladung auf die ursprüngliche Biomasse bezogen (Abb. 5– 22B). Es zeigte sich, dass eine lipophile Extraktion mit Methanol und Dichlormethan die Adsorptionskapazitäten für die Metalle noch erhöht. Die alkalischen Extraktionen zeigten eine Charakterisierung der Bindungsstellen 85 Verringerung der Biosorptionsleistungen für beide Metalle von etwa 20 %. Die Polysaccharide, die durch die alkalische Behandlung extrahiert wurden (60 % der Biomasse), spielen eine weit geringere Rolle für die Biosorption der Metalle als bei C. salina. Durch eine wässrige Extraktion konnten 44 % der Zellwandbestandteile extrahiert werden, die zu einer Abnahme der Kapazitäten der verbleibenden Biomasse von 37 % für Pb und 13 % für Zn führte. Die Mehrzahl der Bindungstellen für die Metalle an L. taylorii befinden sich auf dem nicht extrahierbaren Zellwandgerüst. Die Kenntnis des Extraktionsverhaltens der Algen in Hinblick auf ihre Biosorptionseigenschaften ist auch aus Sicht der technischen Nutzung von Abfallbiomasse als Biosorbens von großer Wichtigkeit, weil solche Extraktionen in der Naturstoffisolierung aus Algen häufig angewendet werden (s. Kap. 2.2.4). 5.2.5 Charakterisierung der Oberfläche Die vorhergehenden Kapitel beschäftigten sich mit Charakterisierung der Bindungstellen durch chemische Verfahren, die die Zellwandstrukturen der Oberfläche der Algen veränderten, um sie dadurch näher zu analysieren. Die folgenden Kapitel benutzen zur Charakterisierung der Bindungsorte nun zerstörungsfreie physikalische und spektroskopische Methoden. Die spektroskopischen Methoden ermöglichen eine direkte Beobachtung der Bindungsorte. 5.2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) Die Grundlagen der Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit einer Röntgmikroanalyse sind in Kap. 4.2.5 dargelegt. Für die experimentellen Bedingungen sei auf Kap. 4.5.7 verwiesen. Die REM in Kombination mit einer Röntgenmikroanalyse ist für die Bestimmung der Elementzusammensetzung der Oberfläche und der Verteilung der Metalle auf der Biomasse ein äußerst hilfreiches System. Die Elementzusammensetzung gerade in Hinblick auf das Vorhandensein weiterer Metalle ist bei den Untersuchungen von Bedeutung. Die Bindungsstellen der Metalle konnten durch diese spektroskopische Methode auf der Oberfläche der Algen näher lokalisiert werden. Die Untersuchungen wurden mit unbeladenen und beladenen Biomasssen von C. salina und L. taylorii durchgeführt. Abb. 5–23A und Abb. 5–24A zeigen jeweils typische REM Aufnahmen von C. salina und L. taylorii. Das REM Bild von C. salina stellt eine Nahaufnahme der Oberfläche dar. Es sind die ineinander zerknäulten Zellwandpolymere sichtbar. Die Abbildung von L. taylorii lässt einen Blick auf die zerklüftete Oberfläche eines Algenpartikels zu. 86 Ergebnisse Zur Analyse der Elemente auf der Oberfläche der Algen wurden die durch die Anregung mit dem Elektronenstrahl von den einzelnen Elementen emittierten Röntgenstrahlen aufgezeichnet und in entsprechenden Spektren dargestellt. In Abb. 5–23 sind die Röntgenspektren der natürlichen (Abb. 5–23B) und mit Pb beladenen (Abb. 5–23C) Oberfläche von C. salina dargestellt. A unbeladen C 1000 B 2000 O 1000 Mg Na Pb beladen C O 500 P S P Ca Na 0 C Pb S Ca Pb 0 0 KeV 10 0 5 KeV Pb 10 Abb. 5–23: REM - Röntgenanalyse an C. salina (A – REM-Aufnahme, B – Röntgenspektrum der natürlichen Alge, C - Röntgenspektrum der mit Pb beladenen Alge) Das Spektrum der unbehandelten C. salina verdeutlicht, dass neben den schon bekannten Elementen (C, O, P und S) auch deutliche Gehalte an den Metallen Mg und Ca auf der Oberfläche vorhanden sind. Geringe Gehalte an Na konnten ebenfalls bestimmt werden. Die Röntgenanalyse an C. salina nach Biosorption von Pb bestätigt das Vorhandensein von Pb auf der Alge mit einem gleichzeitig verringerten Gehalt an Ca. Mg konnte nicht detektiert werden. Das Röntgenspektrum der unbehandelten Alge L. taylorii (Abb. 5–24B) zeigt die gleichen Elemente auf der Oberfläche wie bei C. salina. Die Gehalte an Ca sind jedoch um ein Vielfaches höher. Na und Mg sind nur schwach detektierbar. Die Beladung der Alge mit Pb führt zu dem erwarteten starken Pb Signal im Spektrum und einem beträchtlich niedrigerem Signal für Ca. Die Beladungen der Algen mit Cd, Ni und Zn führt zu ähnlichen Spektren. Die Signale der Schwermetalle sind aufgrund der geringeren Beladung nur entsprechend verringert. 87 Charakterisierung der Bindungsstellen A C 2000 C unbeladen O Ca B 500 Pb beladen O C Pb 1000 Ca PS P Na Mg 0 Pb KeV 10 5 KeV Pb 10 Abb. 5–24: REM - Röntgenanalyse an L. taylorii (A – REM-Aufnahme, B – Röntgenspektrum der natürlichen Alge, C - Röntgenspektrum der mit Pb beladenen Alge) Die Verteilung der einzelnen Schwermetalle auf der Oberfläche der Algen konnte durch Abbildung der entsprechenden Röntgensignale, die in Bildpunkte umgewandelt wurden, sichtbar gemacht werden. Abb. 5–25 illustriert die Verteilung von Pb, Cd, Ni und Zn am Beispiel von L. taylorii. Abb. 5–25: Verteilungsbilder von Pb, Cd, Ni und Zn auf der Oberfläche von L. taylorii 88 Ergebnisse Für die Aufnahme der Verteilungsbilder wurde der größtmögliche Ausschnitt der Gesamtprobe verwendet. Jeder einzelne Bildpunkt symbolisiert ein spezifisches Röntgensignal des entsprechenden Metalls. Für alle vier Metalle lässt sich erkennen, dass die Metalle über die Oberfläche der Alge sehr gleichmässig verteilt sind und einzelne Bereiche mit großer Intensität nicht zu beobachten sind. 5.2.5.2 Bedeutung von Calzium bei der Biosorption an L. taylorii Die Röntgenanalyse von L. taylorii im letzten Kapitel zeigte hohe Gehalte an Calzium auf der Oberfläche. Was passiert mit dem Calzium während der Biosorption der Metalle? Zur Klärung dieser Frage wurden erneute Biosorptionsuntersuchungen (s. Kap. 4.4.2) mit den vier Metallen an L. taylorii durchgeführt. Im Überstand wurden dann nicht nur die Gehalte der einzelnen Metalle untersucht, sondern auch der Calziumgehalt bestimmt (s. Kap. 4.3.3). Diese Sorptionsuntersuchungen an L. taylorii ergaben, dass Calzium durch die Schwermetalle während der Biosorption verdrängt wurde. In Tab. 5–15 sind die Ergebnisse der Versuche dargestellt. Tab. 5–15: Bedeutung von Calzium bei der Biosorption an L. taylorii Metalla qeq (mmol/g Alge) cCa-Überstand (mmol/g Alge) Pb 1,3 1,3 Cd 0,35 0,37 Ni 0,46 0,55 Zn 0,47 0,56 a c0 der Lösungen für Pb 1,2 g/L und für Cd, Ni, Zn 0,2 g/L Für alle vier Metalle ergibt sich, dass die Menge an Schwermetall, die von der Alge adsorbiert wurde, nahezu identisch ist mit der im Überstand gemessen Ca-Konzentration. Ein Biosorptionsversuch mit Millipore-Wasser als Blindwert ergab nur eine vernachlässigbare Konzentration von Calzium, die an die Lösung abgegeben wurde. Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung von Ionenaustauschprozessen bei der Biosorption der vier Metalle an L. taylorii. 5.2.5.3 FT-IR Spektroskopie Zur Identifizierung von charakteristischen funktionellen Gruppen der Zellwandpolymere wurde die FT-IR Spektroskopie verwendet. Für Details zur Infrarot-Spektroskopie und deren Durchführung wird auf die Kap. 4.2.4 und 4.5.5 verwiesen. In Abb. 5–26 sind die FT-IR Spektren von C. salina und L. taylorii abgebildet. 89 Charakterisierung der Bindungsstellen 0.50 0.47 COO- COO- C=O C=O Abs Abs -0.03 4000.00 -0.03 Wavenumber[cm-1] 600.00 4000.00 C. salina Wavenumber[cm-1] 600.00 L. taylorii Abb. 5–26: FT-IR Spektren von C. salina und L. taylorii Die beiden Spektren weisen eine große Ähnlichkeit auf. Da die Oberfläche der Algen ein sehr komplexes polymeres Netzwerk darstellt, ist erwartungsgemäß die Zuordnung von Absorptionsbanden zu einzelnen Molekülgruppen schwierig. Bei Wellenzahlen jenseits von 2600 cm-1 waren keine aufgelösten spezifischen Absorptionsbanden zu erkennen, da die große Zahl an Hydroxylgruppen in diesem Bereich zu einer Vielzahl von Kombinationsschwingungen führte, die in einer breiten Bande resultieren. Die Carbonyl-Streckschwingung (1750 cm-1) und die Absorptionsbande für das Carboxylatanion (1630 cm-1) sind jedoch sehr gut in beiden Spektren zu identifizieren. Diese beiden Schwingungen zeigen, dass Carboxylgruppen in beiden Algen in den Polymeren der Zellwand vorhanden sind. Ein weiteres gutes Beispiel für den Einsatz der FT-IR Spektroskopie zur Charakterisierung von komplexen Oberflächen hinsichtlich funktioneller Gruppen ist in Kap. 5.3.3 gegeben. 5.2.5.4 Spezifische Oberfläche Kommerzielle Adsorbentien werden durch die Angabe ihrer spezifischen Oberfläche charakterisert. Die Bestimmung der spezifischen Oberfläche erfolgte über die Aufnahme einer Stickstoffisotherme bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs und deren Auswertung mit dem Adsorptionsmodel nach Brunauer, Emmett und Teller (BET) (s. Kap. 4.5.6). Da dieses Verfahren sehr aufwendig ist, wurde nur für die beiden leistungsfähigsten Algen die Bestimmung durchgeführt. Die ermittelten Oberflächen der beiden Algen unterscheiden sich erheblich voneinander. L. taylorii besitzt eine spezifische Oberfläche von 4 m2/g, wo hingegen C. salina eine Oberfläche von 15 m2/g aufweist. 90 5.3 Ergebnisse Modifizierung der Biomasse Mit dem Ziel einer Erhöhung der Kapazitäten bzw. einer Beeinflussung der Selektivitäten wurden Experimente zum Einbau zusätzlicher funktioneller Gruppen in die Zellwandpolysaccharide durchgeführt. Ausgehend von einer Vielzahl von Reaktionen, die aus der Cellulosechemie bekannt sind, wurden die getestete Verfahren vor allem nach ihrem Aufwand ausgesucht, da für eine Anwendung die Herstellung kostengünstig und effizient sein sollte. Die chemischen Modifikationen wurden an C. salina und L. taylorii ausgeführt. 5.3.1 Screening von Methoden zur Einführung von funktionellen Gruppen in die Zellwandstrukturen von Algen Unter dem breiten Spektrum von funktionellen Gruppen mit kationischen Eigenschaften nehmen die Phosphat- und Carboxylgruppe eine besondere Stellung ein. Umfangreiche Arbeiten zur Herstellung von Biosorbenzien auf Basis von Holz und Chitin zeigten, dass der Einbau von Phosphat- und Carboxylgruppen in die Biopolymere zu Produkten mit hoher Kapazität und Selektivität gegenüber einer Vielzahl von Schwermetallen führte (Meisch und Gauer, 1998). Die Polysaccharide der Zellwände der Algen bieten zahlreiche Angriffspunkte für solche Derivatisierungen. Die OH-Gruppen der Polysaccharide sind für die Einführung neuer funktioneller Gruppen in die biologische Matrix von besonderer Bedeutung. Im folgenden wurden nun verschiedene Verfahren an den beiden Algen auf ihre Anwendbarkeit getestet. Nach der Modifizierung erfolgten Biosorptionsversuche mit der neuen Biomasse. Die Ergebnisse sind in Tab. 5–16 zusammengefasst. Zur Einführung der Phosphatgruppen in die Algenmatrix wurden drei Methoden angewandt. Der Phosphorgehalt der modifizierten Biomassen wurde durch Elementaranalyse bestimmt (s. Kap. 4.5.1). Wie aus Tab. 5–16 sichtbar unterscheiden sich die Ergebnisse für beide Algen deutlich. Die Zellwandpolymere von C. salina weisen eine geringere Stabilität auf, was die niedrigen Ausbeuten zeigen. Die Veresterung der freien Hydroxylgruppen mit Phosphorsäure in einer Harnstoffschmelze führte bei C. salina zwar zu einer Erhöhung der P-Gehalte; jedoch war die Ausbeute mit 33 % gering. Der Phosphorgehalt konnte verfünffacht werden. Die verbleibende Biomasse besaß eine Kapazitätserhöhung gegenüber Cd und Ni von 50% und Zn von 20%. Durch die zweite Phosphorylierungsmethode, die auf eine Veresterung der Hydroxylgruppen mit Phosphorylchlorid in Pyridin und anschließender Hydrolyse des Säurechlorids zum Phophorsäureester beruht, konnte der P-Gehalt der Biomasse kaum erhöht werden. Die Ausbeute lag um 56 % und eine Verbesserung der Kapazitäten für Pb, Cd und Zn konnte 91 Modifizierung der Biomasse nicht beobachtet werden. Ein Einbau von Phosphatgruppen durch eine Feststoffreaktion mit Phosphorpentasulfid gelang unter den gewählten Bedingungen an C. salina nicht. Die Beladungskapazitäten für die Metalle sanken sogar um etwa 50 %. Tab. 5–16: Ergebnisse der Modifizierungen an der Algenbiomasse P-Gehalt relative Beladung - qeq, mod /q0 mmol/g Pb Cd Ni Zn Phosphorsäurea 33 2,4 0,8 1,5 1,5 1,2 56 0,6 0,7 1,0 1,7 1,0 Phosphorpentasulfitc 47 0,4 0,6 0,4 0,5 0,4 89 4,4 2 6,1 4,6 5,5 Phosphorylchloridb 89 1,5 1,5 1,7 1,5 1,6 Phosphorpentasulfitc 52 0,4 0,2 - 0,2 - Carboxymethylierungd 22 - 2,2 - 2,5 - Oxidatione C. salina Ausbeutef % Phosphorylchloridb Species 18 - 0,9 - - - Methode L. taylorii Phosphorsäurea a f s. Kap. 4.6.1; b s. Kap. 4.6.2; c s. Kap. 4.6.3; d s. Kap. 4.6.4; e s. Kap. 4.6.5 Ausbeute bezogen auf die Menge an eingesetzter Biomasse. Nach den ernüchternden Ergebnissen der Modifizierungen für C. salina waren die Resultate für L. taylorii um so überraschender. Die Feststoffreaktion mit Phosphorpentasulfid zeigte ebenfalls nur eine sehr schlechte Übertragbarkeit auf die Alge. Die beiden anderen Methoden konnten jedoch sehr erfolgreich an L. taylorii angewendet werden. Die Veresterung mit Phosphorylchlorid ergab eine Ausbeute von 89 % und eine Verdreifachung des P-Gehaltes der phosphorylierten Alge. Die Beladungen erhöhten sich zur unbehandelten Alge um 50-70 %. Die Veresterung der freien Hydroxylgruppen mit Phosphorsäure in einer Harnstoffschmelze an L. taylorii stellte die guten Ergebnisse der Phosphorylchlorid-Methode in den Hintergrund. Die Ausbeute betrug ebenfalls 89 %, jedoch stieg der P-Gehalt von 0,5 mmol/g P der unbehandelten L. taylorii auf 4,4 mmol/g P der phosphorylierten Alge an. Der große Anstieg der P-Gehalte bewirkte einen enormen Anstieg der Kapazitäten für Cd (Faktor 6), Ni (Faktor 4,6), und Zn (Faktor 5,5). Die Kapazitäten für Pb wurde nach der Phosphorylierung verdoppelt. 92 Ergebnisse Aus den Erkenntnissen an C. salina wurde die Einführung der Carboxylgruppe in die Biomasse nur an L. taylorii durchgeführt. Bei der Carboxymethylierung wurden Carboxylgruppen durch eine Veretherung der freien Hydroxylgruppen der Biomasse mit Natriummonochloracetat nach vorheriger Mercerisierung mit Natriumhydroxid eingebaut. Die Ausbeute war mit 22 % jedoch sehr gering. Die Beladungen für Pb und Ni verdoppelten sich nach der Behandlung. Die zweite angewandte Methode hat die oxidative Spaltung der Monosaccharidringe zwischen C2 und C3 mit anschließender Weiteroxidation zur Dicarbonsäure zum Prinzip. Diese zweistufige Oxidation führte zu einem starken Abbau der Biomasse (Ausbeute 18 %). Die verwendeten Verfahren zur Erhöhung der Gehalte an Carboxylgruppen sind an L. taylorii nicht weiter anwendbar, da die Reaktionsbedingungen zur Zerstörung der Algenmatrix führten. 5.3.2 Synthese von phosphorylierter L. taylorii Ausgehend von den Bedingungen beim Screening wurde die Synthese hinsichtlich Ausbeute, Einbau von Phosphatgruppen und der Beladungskapazität für Blei optimiert. Die Konzentration der Ausgangsprodukte (Harnstoff, Phosphorsäure) bezogen auf die eingesetzte Biomasse, die Reaktionszeit und –temperatur standen im Mittelpunkt der Optimierung. Die Optimierungsversuche wurden mit jeweils 500 mg Biomasse pro Ansatz durchgeführt. In Abb. 5–27 ist die Abhängigkeit der Beladung für Pb, der Phosphorgehalt und die Ausbeute an modifizierter Biomasse von der Reaktionszeit bei 170 °C dargestellt. Nach der Vortrocknung hat die Biomasse um über 50 % abgenommen und die Beladungskapazität für Blei ist stark abgesunken im Vergleich zur nativen Biomasse. Bereits nach einer Reaktionszeit von 60 min ist der P-Gehalt und die Beladung für Blei sprunghaft angestiegen und ändert sich im folgenden nur noch geringfügig. Dahingegen steigt die Ausbeute der Biomasse bis 3 h Reaktionszeit auf etwa 100 % und ist dann konstant. Da die P-Gehalte konstant sind, führt eine längere Reaktionszeit zu einer erneuten Bildung von Polymeren. Im folgenden wurden die Konzentrationen der Ausgangsstoffe optimiert. Wie aus Abb. 5–28 zu erkennen ist, stellt sich die aus der Originalmethode verwendete Harnstoffkonzentration von 74 mmol pro g Alge als optimal dar. Höhere Harnstoffkonzentrationen führen zu immer geringeren Ausbeuten an Biomasse. Bei Einsatz der halben Ausgangskonzentration für Harnstoff sinkt im erhaltenen Produkt die P-Gehalte und parallel dazu die Bleibeladungen ab. Die Ausbeute ist ebenfalls niedriger. 93 Modifizierung der Biomasse 4,5 3,5 58 % 2,5 4,0 103 % 84 % 104 % 3,5 3,0 2,0 2,5 1,5 2,0 Pb (2,5 g/L) 1,0 1,5 P P-Gehalt (mmol/g) qeq (mmol/g) 3,0 1,0 0,5 0,5 47 %* 0,0 240 0,0 0 40 80 120 160 Reaktionszeit - 170 °C (min) * Ausbeute 200 Abb. 5–27: Einfluss der Reaktionszeit bei 170 °C auf die Ausbeute, Pb-Beladung und PGehalt von L. taylorii phos. Durchführung. s. Kap. 4.6.1, Biosorption von Pb s. Kap. 4.4.2 5,0 3,5 qeq (mmol/g) 3,0 99 % 4,0 47 % 74 % 3,5 2,5 3,0 2,0 2,5 Pb (2,5 g/L) 62 %* P P-Gehalt (mmol/g) 4,5 2,0 1,5 1,5 1,0 1,0 0 * Ausbeute 40 80 120 160 cHarnstoff (mmol/g Alge) Abb. 5–28: Einfluss der Harnstoffkonzentration auf die Ausbeute, Pb-Beladung und PGehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C) Durchführung. s. Kap. 4.6.1, Biosorption von Pb s. Kap. 4.4.2 94 Ergebnisse Die Versuche zum Einfluss der Phosphorsäurekonzentration auf die Synthese von L. taylorii phos. zeigten erneut, dass die verwendete Konzentration von 18 mmol /g aus der Originalmethode optimal ist (s. Abb. 5–29). Aus dem Einsatz der halben bzw. doppelten Säuremenge resultierten Produkte mit schlechteren Eigenschaften bezüglich Pb-Beladung, P-Gehalt und Ausbeute. 5,0 3,5 qeq (mmol/g) 3,0 4,0 99 % 3,5 2,5 3,0 2,0 2,5 64 %* 54 % Pb (2,5 g/L) 1,5 P-Gehalt (mmol/g) 4,5 2,0 P 1,5 1,0 1,0 0 8 * Ausbeute 16 24 cH3PO4 (mmol/g Alge) 32 40 Abb. 5–29: Einfluss der Phosphorsäurekonzentration auf die Ausbeute, Pb-Beladung und PGehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C) Durchführung. s. Kap. 4.6.1, Biosorption von Pb s. Kap. 4.4.2 Ausgehend vom optimalen Verhältnis der Ausgangsstoffe von 18 mmol/g Phosphorsäure zu 74 mmol/g Harnstoff wurde untersucht, ob eine Änderung der eingesetzten Menge an Ausgangsstoffen eine Verbesserung der modifizierten L. taylorii bringt. Dazu wurden Versuche mit einem Viertel, der Hälfte und dem doppelten Ansatz der beiden Edukte im optimalen Verhältnis zueinander durchgeführt. Wie Abb. 5–30 zeigt, steigt der P-Gehalt und die Beladung bis zum Ausgangsansatz deutlich an. Nach Verdoppelung des Ansatzes ändern sich die Parameter nur noch geringfügig. Der eigentliche Ansatz wird somit als optimal angesehen. Als letzter Parameter wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Phosphorylierung betrachtet. Aus der Abb. 5–31 lässt sich erkennen, dass im Temperaturbereich von 160 °C bis 200 °C die Bleibeladung wie auch der P-Gehalt annähernd konstant sind. Temperaturen über 210 °C führen zu einer deutlichen Abnahme der Beladung, des P-Gehaltes und der Ausbeute. Die Ausbeute an Biomasse nimmt von 170 °C bis 200 °C stetig zu. Bei 200 °C Reaktionstemperatur beträgt die Ausbeute 142 %. Für die weiteren Synthesen wird deshalb eine Reaktionstemperatur von 200 °C verwendet. 95 Modifizierung der Biomasse 5,5 3,5 qeq (mmol/g) 2,5 4,5 89 % 99 % 4,0 3,5 2,0 107 % 3,0 2,5 1,5 Pb (2,5 g/L) 1,0 2,0 P P-Gehalt (mmol/g) 5,0 3,0 1,5 89 %* 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 xfache des Ansatzes Harnstoff / H3PO4 * Ausbeute 2,0 d Abb. 5–30: Einfluss der eingesetzten Mengen an Harnstoff und Phosphorsäure auf die Ausbeute, Pb-Beladung und P-Gehalt von L. taylorii phos. (T = 170 °C) Durchführung. s. Kap. 4.6.1, Biosorption von Pb s. Kap. 4.4.2 119 % 5,0 119 % 3,0 qeq (mmol/g) 5,5 99% 111% 97%* 4,5 142 % 4,0 2,5 3,5 3,0 2,0 Pb (2,5 g/L) 2,5 P 2,0 45 % 1,5 P-Gehalt (mmol/g) 3,5 1,5 1,0 1,0 150 * Ausbeute 160 170 180 190 200 210 220 230 Reaktionstemperatur (°C) Abb. 5–31: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Ausbeute, Pb-Beladung und P-Gehalt von L. taylorii phos. Durchführung. s. Kap. 4.6.1, Biosorption von Pb s. Kap. 4.4.2 Um die Synthese an den Bedarf an phosphorylierter L. taylorii für den gesamten Projektbereich anzupassen, wurden der Ansatz auf 5 g Biomasse pro Synthese unter den optimierten Bedingungen erweitert. Die Ausbeute an phosphorylierter L. taylorii lag über 94 % für alle bisher durchgeführten Synthesen. Der Phosphorgehalt der modifizierten Biomasse lag durch- 96 Ergebnisse schnittlich bei 4,4 mmol Phosphor pro g Alge. Für den Projektbereich wurden insgesamt mehr als 50 g phosphorylierter L. taylorii mit reproduzierbaren Beladungskapazitäten hergestellt. 5.3.3 Charakterisierung der modifizierten L. taylorii Der P-Gehalt von L. taylorii konnte von 0,5 mmol/g der nativen Alge auf über 4 mmol/g bei der behandelten Alge erhöht werden. Ein solcher Einbau von Phosphatgruppen in die Zellwandpolymeren von L. taylorii sollte im IR-Spektrum der Biomasse sichtbar werden. Abb. 5– 32 stellt die Spektren der unbehandelten und behandelten Alge gegenüber. P=O L. taylorii L. taylorii phos. Abb. 5–32: FT-IR-Spektren von L. taylorii und L. taylorii phos. Das linke Spektrum zeigt die native L. taylorii, welches in Kap. 5.2.5.3 erläutert wurde. Im rechten Spektrum (L. taylorii phos.) sind nun deutlich die charakteristischen Schwingungen der Phosphatgruppe zu erkennen. Die Absorptionsbanden der P-O-H (920 cm-1) und vor allem der P=O Schwingungen (1270 cm-1) können im Spektrum klar charakterisiert werden. Die Carbonyl-Streckschwingung (1750 cm-1) ist ebenfalls gut im Spektrum zu identifizieren. Der Bereich über Wellenzahlen von 2600 cm-1 war wiederum durch eine breiten Bande gekennzeichnet, da es in diesem Bereich zu einer Vielzahl von Kombinationsschwingungen kommt. Abschließend wurde die phosphorylierte L. taylorii mittels REM in Kombination mit einer Röntgenanalyse untersucht. Ein entsprechendes REM Bild und ein Röntgenspektrum sind in Abb. 5–33 gezeigt. Das REM Bild gibt einen Eindruck von der Oberfläche der Biomasse wieder und zeigt die ineinander verknäulten Polymerstränge deutlich. Das Röntgenspektrum bestätigt den deutlich erhöhten Gehalt an Phosphor. Geringe Mengen an Ca und Mg konnten detektiert werden. 97 Modifizierung der Biomasse C 1000 P O 500 Mg S Ca 0 0 10 KeV Abb. 5–33: REM - Röntgenanalyse an L. taylorii phos. (links – REM-Aufnahme, rechts – Röntgenspektrum der phosphorylierten Alge) 5.3.4 Biosorptionseigenschaften von L. taylorii phos. In diesem Kapitel stehen Untersuchungen zur Biosorption der Schwermetalle Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an dem neuen Biosorbens in Hinblick auf Isothermen, Kinetik, pH-Abhängigkeit, Selektivität und Einfluss von Fremdsalzen im Mittelpunkt. 5.3.4.1 Adsorptionsisothermen – L. taylorii phos. Nach der Optimierung der Synthesebedingungen für die Herstellung von L. taylorii phos. wurden die Adsorptionsisotherme für Cd, Cu, Ni, Pb und Zn aufgenommen (s. Abb. 5–34). 3,2 2,8 qeq (mmol/g) 2,4 2,0 1,6 Cd 1,2 Cu Pb Ni Zn 0,8 0,4 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–34: Adsorptionsisothermen nach Langmuir von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 98 Ergebnisse In Abb. 5–34 sind die experimentellen Daten und die nach dem Modell von Langmuir (s. Gl. 2–1) berechneten Isothermen dargestellt. Die Adsorptionsisothermen für die Schwermetalle zeigen einen sehr ähnlichen Verlauf, wobei Pb höhere Beladungen zeigt. Die experimentellen Daten lassen sich hervorragend mit dem Modell von Langmuir beschreiben. Durch eine Linearisieung der Langmuirgleichung (Gl. 2–2) können die Langmuirparameter aus den Geradengleichungen berechnet werden. Die linearisierten Adsorptionsisothermen sind in Abb. 5–35 dargestellt und zeigen die sehr gute Korrelationen der gemessenen Daten mit dem Modell (r2 > 0,999). 0,006 Cd 0,005 Pb Ni Zn y = 0,0004x - 3E-06 r2 = 0,9999 y = 0,0004x + 2E-05 2 r = 0,9993 0,004 ceq/qeq Cu 0,003 y = 0,0004x + 6E-05 2 r = 0,9995 y = 0,0003x + 6E-06 2 r = 0,9999 0,002 0,001 y = 0,0004x + 2E-05 2 r = 0,9998 0,000 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 ceq (mmol/L) Abb. 5–35: Linearisierte Adsorptionsisothermen von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. nach dem Adsorptionsmodell von Langmuir Die aus den Regressionsgeraden berechneten maximalen Beladungskapazitäten und Langmuirkonstanten sind in Tab. 5–17 abgebildet. Die erhaltenen maximalen Beladungen von 3,08 mmol Blei; 2,52 mmol Cadmium; 2,40 mmol Kupfer; 2,79 mmol Nickel und 2,60 mmol Zink pro g Biotrockenmasse sind die höchsten ermittelten Beladungen aller bisher untersuchten Biosorbenzien in dieser Arbeit (Pb > Ni > Zn > Cd > Cu.). Bei Betrachtung der ermittelten Langmuirkonstanten zeigt sich eine starke Affinität von Zn zur Oberfläche der Alge. Im Unterschied dazu zeigt Ni nur ein zwanzigstel der Affinität. Aus den berechneten Langmuirkonstanten lässt sich folgende Reihenfolge der Affinitäten angeben: Zn >> Pb > Cd ≥ Cu > Ni. 99 Modifizierung der Biomasse Tab. 5–17: Langmuirparameter für Adsorptionsiosthermen an L. taylorii phos. Metall qmaxa bb Cd 2,52 20 Cu 2,40 18 Ni 2,79 6,4 Pb 3,08 57 Zn 2,60 135 a b qmax in mmol/g; Langmuirkonstante in L/mmol 5.3.4.2 Kinetik Die Kenntnis des zeitlichen Verlaufes der Bindung der Metalle an der Oberfläche ist bedeutend, da sie Auskunft über das erreichen des Gleichgewichtszustandes der Biosorption gibt. Abb. 5–36 zeigt die Abhängigkeit der Beladung von der Kontaktzeit der Algen in der entsprechenden Metalllösung. 1,0 Cd (1)* Cu (0,8) Ni (1) Pb (2) Zn (1) c / c0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * c0 g/L 20 40 60 80 100 120 Zeit (min) Abb. 5–36: Kinetik der Metallbindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Die Schwermetallaufnahme verläuft auch bei L. taylorii phos. sehr schnell. Bereits nach einer Kontaktzeit von 5 min in der Lösung war das Gleichgewicht für Pb, Cd, Ni und Zn vollständig eingestellt. Für Cu konnte eine vollständige Einstellung des Gleichgewichts nach 17 min 100 Ergebnisse beobachtet werden. Die angewendete Reaktionszeit von 30 min ist somit ausreichend für die Gleichgewichtseinstellung. 5.3.4.3 pH-Abhängigkeit Inwieweit die eingebauten Phosphatgruppen einen Einfluss auf die pH-Abhängigkeit der Biosorption der Metalle haben, zeigten Versuche mit der modifizierten L. taylorii. Abb. 5–37 verdeutlicht, dass sich die Konkurrenz der Protonen im Vergleich zur unbehandelten Alge stark verändert hat. Die Biosorptionskapazitäten für Blei und Cadmium sind konstant über den pH-Bereich von 4 bis 6 und sinken um nur 9 % für Blei und 28 % für Cadmium bei pH 1. Die Sorption von Kupfer ist über den Bereich von pH 3 bis 5 konstant und fällt um 55 % bei pH 1. Die Beladungen für Zink sind sogar über den gesamten untersuchten pHBereich konstant. Wie in Abb. 5–37 gezeigt, erniedrigt sich die Beladung für Nickel mit geringerem pH-Wert der Lösung. Die Beladung sinkt von 2,7 mmol/g bei pH 6,3 auf 1,73 mmol/g bei pH 1,1. Die Kapazität für Ni bei pH 1,1 beträgt aber immer noch 64 % der bei pH 6. 3,0 qeq (mmol/g) 2,4 1,8 1,2 Cd (1)* 0,6 Cu (0,8) Ni (1) Pb (2) Zn (1) 4 5 6 0,0 1 2 * c0 g/L 3 7 pH Abb. 5–37: pH-Abhängigkeit der Biosorption von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4 Die Bindungskapazitäten für alle Metalle an der phosphorylierten Alge sind bei pH 1 deutlicher höher verglichen mit L. taylorii. Die gute Biosorption der modifizierten Alge bei niedrigen pH-Werten stellt jedoch ein Problem bei der Desorption der Metalle dar. Die Desorption erweist sich als deutlich schwieriger Modifizierung der Biomasse 101 im Vergleich zur unbehandelten L. taylorii. Versuche zeigten, dass die Metalle erst mit einer 3 N Salzsäure von der modifizierten Alge desorbiert werden können (im Mittel über 90 % für Cd, Cu und Zn; 64 % für Pb und 79 % für Ni). 5.3.4.4 Selektivität der Metallbindung Da das neue Biosorbens sehr ähnliche Bindungskapazitäten für alle Metalle zeigte, stellte sich die Frage, ob auch eine Veränderung der Selektivität bei der Metallsorption zu beobachten ist. Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Konkurrenz der Metalle in äquimolaren Lösungen sind in Tab. 5–18 zusammengefasst. Abb. 5–38A-C verdeutlicht die Abhängigkeiten der einzelnen Metalle in den komplexeren Metallgemischen (> 4 Metalle) grafisch und dient somit einer besseren Übersichtlichkeit. Ausgehend von einer Mischung von Cd, Ni, Pb und Zn wurde untersucht, wie sich die Beladungen für die vier Metalle bei steigenden Metallkonzentrationen (1-10 mmol/L) verhalten. Abb. 5–38A verdeutlicht, dass mit steigenden Metallkonzentrationen Pb bevorzugt gebunden wird und die anderen drei Metalle von den Bindungstellen verdrängt werden. Ni wurde am stärksten beeinflusst und eine Beladung konnte ab einer Konzentration von 6 mmol/L nicht mehr nachgewiesen werden. Die Biosorption von Cd und Zn steigt bis zu einer Anfangskonzentration von 3 mmol/L an und sinkt danach auf niedrige, konstante Beladungen ab. Ein Anstieg der Beladungen an Cd und Zn konnte so lange beobachtet werden, wie die Beladungen für Pb nicht im Sättigungsbereich waren (s. Tab. 5–18). Die Selektivität in einer Metalllösung der vier Metalle lässt sich in folgender Reihenfolge zusammenfassen: Pb >> Zn ≈ Cd > Ni. Die Betrachtung aller fünf untersuchten Metalle in einer Lösung ergab ein ähnliches Resultat (s. Abb. 5–38B). Pb verdrängt auch das Cu von den Bindungsstellen bei steigenden Metallkonzentrationen. Die Selektivitäten der anderen Metalle untereinander sind durch die Dominanz von Blei schwer einzuschätzen. Deshalb wurden weitere Untersuchungen ohne Blei durchgeführt. Die Selektivität von L. taylorii gegenüber den fünf Metalle ergibt sich zu Pb >> Zn > Cu > Cd >Ni. In Abb. 5–38C sind die Ergebnisse der Konkurrenz von Cd, Cu, Ni und Zn um die Bindung an L. taylorii phos. in äquimolaren Lösungen dargestellt. Cd und Cu verhalten sich sehr ähnlich bei ihrer Bindung an der Oberfläche. Die Beladungen von Zn steigen mit steigender Anfangskonzentration deutlich an, was eine Selektivität von Zink gegenüber den drei anderen Metallen zeigt. Die Biosorptionskapazitäten von Ni sind am niedrigsten, sie nehmen in Gegenwart höherer Konzentrationen der konkurrierenden Metalle weiter ab. 102 Ergebnisse A 3,2 2,8 qeq (mmol/g) 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 n.n. n.n. n.n. 10 8 6 4 c0 (mmol/L) 0,4 0,0 Pb Cd Zn Ni 3 2 1 3,0 B qeq (mmol/g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Pb C Cd Zn Cu Ni 6 4 2 10 8 c0 (mmol/L) 0,9 0,8 qeq (mmol/g) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Cd Cu Zn Ni 2 4 6 8 c0 (mmol/L) Abb. 5–38: Konkurrenz der Bindung von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an L. taylorii phos. Die Versuche wurden mit Mehrmetall-Lösungen (gleiche molare Konzentration der einzelnen Metalle) unterschiedlicher Anfangskonzentrationen (c0) durchgeführt. n.n. – Biosorption nicht nachweisbar. Parameter s. Kap. 4.4 103 Modifizierung der Biomasse Tab. 5–18: Selektivität der Metallbindung an L. taylorii phos. nMeb c0 5 Pba c d Cu 2 100 Ni Zn Σ qeq Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq Ads. qeq 0,92 62 0,54 33 0,29 100 0,76 56 0,47 2,99 91 1,82 24 0,44 11 0,20 13 0,21 16 0,25 2,92 6 78 2,25 12 0,33 7 0,17 9 0,22 12 0,29 3,27 8 63 2,39 5 0,17 5 0,17 3 0,09 6 0,18 3,00 10 56 2,75 4 0,18 3 0,14 2 0,07 10 0,39 3,53 2 73 0,67 46 0,40 64 0,53 69 0,58 2,18 4 39 0,67 22 0,38 38 0,63 45 0,75 2,44 6 28 0,75 15 0,40 29 0,75 29 0,67 2,57 8 4 qeq 4 4 Ads. e Cd 21 0,75 8 0,28 23 0,82 23 0,75 2,61 0,33 98 0,45 97 0,39 99 0,37 1,54 100 0,73 78 0,69 44 0,35 99 0,67 2,44 3 100 1,17 55 0,74 18 0,23 99 1,08 3,22 4 93 1,42 40 0,71 3 0,04 28 0,45 2,62 6 83 2,25 19 0,53 n.n.f 9 0,21 2,99 8 71 2,53 13 0,45 n.n. 10 0,31 3,29 10 58 3,02 6 0,33 n.n. 7 0,33 3,68 4 60 1,04 33 0,57 51 0,87 2,48 6 40 1,07 26 0,69 38 1,01 2,77 8 26 0,90 16 0,57 33 1,14 2,61 10 a 97 2 3 1 19 0,83 11 0,51 25 1,10 2,44 RSD (n=3) ≤ 3 % Pb, ≤ 8 % Cd; ≤ 17% Ni und ≤ 10 % Zn Anzahl der Metalle in Lösung c Anfangskonzentration der Mehrmetalllösungen mit gleicher molarer Konzentration der einzelnen Metalle in mmol/L d Adsorptionseffizienz aus der Lösung in % e qeq in mmol/g f Biosorption nicht nachweisbar b 104 Ergebnisse Eine vollständige Verdrängung von Ni findet aber auch bei der höchsten untersuchten Konzentration aller Metalle in Abwesenheit von Pb nicht statt. Versuche mit Cd, Ni und Zn in einer Lösung bestätigten die leichte Dominanz von Zn gegenüber von Cd und Ni (s. Tab. 5– 18). Aus den vorhergehenden Experimenten kann somit folgende Selektivitätsreihe festgelegt werden: Pb >> Zn > Cd ≈ Cu > Ni. 5.3.4.5 Einfluss von Fremdsalzen auf die Biosorption Zum Abschluss der Charakterisierung der Biosorptionseigenschaften an L. taylorii phos. wurde die Konkurrenz von ein- und zweiwertigen Fremdsalzen um die Bindungsstellen der Schwermetalle Cd, Cu, Ni, Pb und Zn untersucht. Das einwertige Natriumion (Na) (Natriumchlorid) und das zweiwertige Calciumion (Ca) (Calciumchlorid) standen im Mittelpunkt der Versuche. Die Ergebnisse sind in Abb. 5–39 und Abb. 5–40 grafisch dargestellt. Der untersuchte Konzentrationsbereich für die beiden Metallionen erstreckt sich zwischen 0,4 g/L bis 20 g/L. Die Schwermetallkonzentrationen in den Lösungen lagen im Sättigungsbereich der modifizierten Biomasse (0,8 – 2 g/L). 3,2 2,8 qeq (mmol/g) 2,4 2,0 1,6 1,2 Cd (1)* Cu (0,8) 0,8 Ni (1) Pb (2) 0,4 Zn (1) 0,0 0 * c0 g/L 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 cNa (g/L) Abb. 5–39: Einfluss von Natriumionen auf die Biosorption an L. taylorii phos. Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Eine Konkurrenz der Na-Ionen auf die Biosorption konnte für alle Metalle beobachtet werden (Abb. 5–39). Die Abbildung zeigt deutlich, dass die Biosorption von Cu und Zn geringer beeinflusst wird als für die anderen Metalle. Eine Konzentration von 0,4 g/L Na in der Lösung 105 Modifizierung der Biomasse bewirkte noch keine Änderung in der Beladung von Cu und Zn. Eine weitere Erhöhung der Na-Konzentration auf 20 g/L führte zu einer Abnahme der Beladungen um bis zu 31 % bei Zn und 26 % bei Cu. Im gleichen Konzentrationsbereich für Na erniedrigten sich die Biosorptionskapazitäten für Pb um bis zu 69 % (20 g/L Na), für Cd um bis zu 64 % und für Ni um bis zu 58 % der ursprünglichen Kapazitäten. Ni zeigte einen besonders starken Abfall der Beladung von 14 % schon bei einer Na Konzentration von 0,4 g/L. Trotz der Konkurrenz von Na konnte die Biomasse bei 20 g/L Na noch 1 mmol/g Pb; 0,9 mmol/g Cd; 1,8 mmol/g Cu; 1,2 mmol/g Ni und 1,8 mmol/g Zn adsorbieren. Die modifizierte Biomasse zeigt einen größeren Einfluss von Ca auf die Biosorption der Metalle im Vergleich zum Na (s. Abb. 5–40). 3,2 Cd (1)* Cu (0,8) 2,4 qeq (mmol/g) 2,8 Pb (2) Zn (1) Ni (1) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0 * c0 g/L 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 cCa (g/L) Abb. 5–40: Einfluss von Calciumionen auf die Biosorption an L. taylorii phos. Die Versuche wurden jeweils mit nur einem Metall in Lösung durchgeführt. Parameter s. Kap. 4.4. Bereits ein Gehalt von 0,4 g/L Ca in den Lösungen führte zu einer Abnahme der Beladung von Cd um 45 %, Ni um 46 %, Zn um 28 % und Cu um 24 %. Pb zeigte eine klare Erniedrigung der Beladung ab einem Ca-Gehalt von 4 g/L auf 54 % der ursprünglichen Kapazität, die weiter auf eine Kapazität von 24 % bei 18 g/L Ca fielen. Am stärksten beeinflusst wurde die Biosorption von Cd und Ni durch Ca. Bei einer Ca Konzentration von 18 g/L wurde die Beladung für Cd um 92 % und für Ni um 90 % verringert. Die geringste Konkurrenz mit Ca zeigte wiederum Cu, wo bei 18 g/L Ca in der Lösung eine Abnahme der Biosorptionsleistung um 53 % beobachtet wurde. Die Beladungen für Zn sinken bei 18 g/L um 77 % auf 0,86 mmol/g Biomasse. 106 6 Zusammenfassung und Diskussion Zusammenfassung und Diskussion Im Sonderforschungsbereich (Sfb) 193 "Biologische Behandlung industrieller und gewerblicher Abwässer" der Technischen Universität Berlin wurden seit 1997 in zwei Teilprojekten Grundlagenkenntnisse über die Ausnutzung des natürlichen Prozesses der Biosorption von Schwermetallen an Algen für die Abwasserreinigung erarbeitet. Die verwendeten Algen wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. R. Buchholz am Institut für Biotechnologie der TU Berlin taxonomisch bestimmt und kultiviert. 6.1 Biosorptionsuntersuchungen Für die Untersuchungen wurden ausschließlich tote, gefriergetrocknete Algenbiomassen hinsichtlich ihrer Biosorptioneigenschaften gegenüber den ausgewählten Schwermetallen verwendet. Der Vorteil in der Anwendung von toter Biomasse wird in der Literatur vielfältig beschrieben (s. Kap. 2.3.2), er liegt für die Reinigung von industriellen Abwässern in der besseren Handhabung eines Verfahrens begründet (Immobilisierung, Toxizität der Abwässer). Ausgangspunkt der Arbeit stellten Untersuchungen an der Chlorophyceae C. vulgaris dar, die als Standard für die weiteren Arbeiten galt. Die Biosorption der Schwermetalle Pb, Cd, Ni und Zn konnte mit dem Adsorptionsmodell nach Langmuir gut beschrieben werden. Eine Linearisierung der Adsorptionsisothermen ermöglichte durch die Berechnung der maximalen Beladungskapazitäten (qmax) und der Langmuirkonstanten b für die einzelnen Metalle eine quantitative Beschreibung der Sorptionsvorgänge an der Alge. In einer Zusammenfassung ihrer Arbeiten verdeutlichten Volesky und Holan (1995), dass sich das Modell nach Langmuir für die Beschreibung der Biosorption einer Vielzahl von untersuchten marinen Makroalgen eignet und die erhaltenen Parameter eine Vergleichbarkeit mit anderen Sorbenzien erlaubt. In den letzten Jahren hat sich dieser Ansatz in vielen Arbeiten verschiedener Forschungsgruppen durchgesetzt (Yu et al., 1999; Schneider und Rubio, 1999; Pagnanelli et al., 2000; Kapoor et al., 1999; Matheickal et al., 1999). An C. vulgaris wurden maximale Beladungen von 0,3 mmol Cd; 0,4 mmol Ni; 0,5 mmol Pb und 0,4 mmol Zn pro g Alge ermittelt. Cd zeigte die größte Affinität (Langmuirkonstante) zur Oberfläche der Alge gefolgt von Pb, Zn und Ni. In der Literatur sind nur wenige quantitative Metallbindungsstudien an C. vulgaris beschrieben, die aufgrund unterschiedlicher Versuchsbedingungen nur schwer zu vergleichen sind. So werden beispielsweise maximale Beladungskapazitäten für Ni an C. vulgaris von 0,02 mmol (Wong et al., 2000); 0,21 mmol (Lau et al., 1999) und 1 mmol (Donmez et al., 1999) pro g Biomasse angegeben. Die Gleichgewichtseinstellung der Metalle an der Alge erfolgte inner- 107 Biosorptionsuntersuchungen halb von wenigen Minuten in den Batchversuchen. Für die folgenden Screeninguntersuchungen wurde deshalb eine Reaktionszeit von 30 min für die Gleichgewichtseinstellung als ausreichend angesehen. Im schwach sauren pH-Bereich von 4-6 ist die Beladung von Cd, Pb und Zn annähernd konstant. Nur Ni zeigt eine leichte Abnahme der Beladung bei pH 4. Zum sauren pH-Bereich (pH 1) hin nimmt die Kapazität ab, dadurch wird eine Desorption der beladenen Algen mit verdünnter Säure ermöglicht. Die Kinetik und pH-Abhängigkeiten der Biosorption an C. vulgaris stimmt mit den Ergebnissen von Lau et al. (1999) und Aksu (2001), die Untersuchungen an C. vulgaris mit Cu und Ni bzw. Cd durchführten, überein. Aus der Charakterisierung der Biosorption an C. vulgaris leiteten sich die Bedingungen für das folgende Screening von weiteren Algen ab. Aus dem Verlauf der Sorptionsisothermen an C. vulgaris wird deutlich, dass im unteren Konzentrationsbereich, wo die Bindungstellen noch nicht gesättigt sind, eine kleine Änderung der Gleichgewichtskonzentration eine große Änderung der Beladung bedingt. Im Sättigungsarm der Isotherme sind die Änderungen deutlich geringer. Deshalb wurde für das Screening die Anfangskonzentrationen der einzelnen Metalle an dem Sättigungsbereich von C. vulgaris angelehnt. 0,9 0,8 qeq (mmol/g) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Pb (400 mg/L) C. salina V. dichotoma C. vulgaris P. tricornutum C. spezies P. spezies D. bioculata Abb. 6–1: Cd (100 mg/L) S. hofmani C. kessleri G. longicauda M. aeroginosa A. cylindrica A.africanum L. taylorii M. spezies R. spiculiforme P. purpureum S. laxissima E. magnus Ni (100 mg/L) A. densus N. parmeloides A. hantzschii T. spezies G. planctonica D. salina Zn (100 mg/L) K. spiculiformis S. maxima S. platensis G. verrucosa S. spezies A. inaequealis Screening der Biosorption von Pb, Cd, Ni und Zn an 31 Algen Details s. Kap. 5.1.2 Die Wahl der Anfangskonzentrationen im Sättigungsbereich von C. vulgaris für die Screeninguntersuchungen ist notwendig, da ansonsten die Beladungskapazitäten nicht vergleichbar sind (Volesky, 1994; Volesky und Holan, 1995; Matheickal und Yu, 1996). Im Screening wurden 30 weitere Algen aus unterschiedlichen taxonomischen Klassen auf ihre Sorptionsfä- 108 Zusammenfassung und Diskussion higkeiten gegenüber den vier Metallen untersucht. In Abb. 6–1 sind die Ergebnisse grafisch zusammengefasst. Die Abbildung zeigt die große Bandbreite in den Biosorptionsleistungen der einzelnen Algenarten. Ein Zusammenhang zwischen der taxonomischen Klasse einer Alge und den Biosorptionskapazitäten konnte nicht erkannt werden. Zu den leistungsfähigsten Arten zählen die Chlorophyceae C. salina, die Cyanophyceae S. hofmani und L. taylorii. Gleichzeitig stellen mit der Cyanophyceae A. inaequealis und der Chlorophyceae D. bioculata zwei Vertreter dieser taxonomischen Klassen auch die schwächsten Biosorbenzien im gesamten Screening dar. Pb wurde von den meisten Algen am stärksten adsorbiert. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung des Screenings, da zwischen den einzelnen Algen große Unterschiede in den Bindungskapazitäten für die einzelnen Metalle bestehen. Waren die besten Algen in der Lage das vorgegebene Pb fast vollständig aus der Lösung zu binden, so konnte D. bioculata nur 3 % des vorhandenen Pb entfernen. C. salina und L. taylorii wurden zur weiteren Charakterisierung von den untersuchten Algen ausgewählt. In den Übersichtsartikeln von Volesky und Holan (1995) und Veglio und Beolchini (1997) wird ebenfalls eine große Diversität der Kapazitäten für die Metalle an unterschiedlichen Biosorbenzien demonstriert. Pb zeigte auch hier deutlich höhere Beladungen gegenüber den anderen Metallen. Die guten Biosorptioneigenschaften der Cyanophyceae gegenüber anderen Biosorbenzien wurden von Fehrmann und Pohl (1994) und Inthorn et al. (1996), die die Biosorption von Cd an verschiedenen Cyanophyceae untersuchten, beschrieben. Die Biosorptionseigenschaften von C. salina und L. taylorii wurden im weiteren näher untersucht, wobei L. taylorii im Verlauf der Untersuchungen immer stärker in den Vordergrund rückte, da die Überführung der Alge in ein technisches Verfahren (Immobilisierung) im Kooperationsprojekt besonders vielversprechend funktionierte (Wilke, 2001). Die Versuche an L. taylorii wurden deshalb um das Schwermetall Cu noch erweitert. Die Sorptionsisothermen der einzelnen Metalle an den beiden Algen konnten wie bei C. vulgaris mit Modell von Langmuir quantitativ beschrieben werden. An C. salina wurden maximale Beladungen nach Langmuir von 0,9 mmol Cd; 0,6 mmol Ni; 1,9 mmol Pb und 0,9 mmol Zn pro g Biomasse erreicht (Pb > Zn > Cd > Ni). Die Affinität von Pb ist besonders hoch. Ni zeigt die geringste Affinität zur Oberfläche (Affinitätsreihenfolge: Pb >> Cd > Zn > Ni). Die maximalen Kapazitäten an L. taylorii waren mit 0,4 mmol Cd; 0,7 mmol Cu; 0,7 mmol Ni; 1,47 mmol Pb und 0,5 mmol Zn pro g Alge (Pb > Cu ≥ Ni > Zn > Cd) für Pb, Cd und Zn niedriger als bei C. salina. Die Affinitäten der Metalle zur Oberfläche von L. taylorii sind für Biosorptionsuntersuchungen 109 Zn, Pb, Cd und Cu in einem Bereich. Ni zeigt wie bei den beiden anderen Algen die geringste Affinität (Zn ≥ Pb ≥ Cd > Cu > Ni). Die höchsten max. Beladungen konnten für alle drei untersuchten Algen (C. vulgaris, C. salina und L. taylorii) für Pb beobachtet werden. Leusch et al. (1996) berichten, dass die Beladungen an der marinen Makroalge Saragassun fluitans für Pb am höchsten sind gefolgt von Cu, Ni, Cd und Zn. Die Affinität von Ni an Saragassun fluitans erwies sich am geringsten von den fünf Metallen. Die Kapazitäten von C. salina und L. taylorii lassen sich mit den besten bisher beschriebenen Biosorbenzien gut vergleichen (s. Tab. 2–5) und sind deutlich höher als für Zeolithe und Aktivkohle (Volesky, 1994; Dorfner, 1991). Die beeindruckenden Kapazitäten für Pb übertreffen selbst den in dieser Arbeit als Vergleich herangezogenen kommerziellen Ionenaustauscher DW 22, der ansonsten mit Beladungen über 1,1 mmol/g für Cd, Ni und Zn besser ist. Unter den Vergleichssorbenzien sei an dieser Stelle noch das Carbion erwähnt, das mit maximalen Beladungen von 2,6 mmol/g für Pb und 1,7 – 1,9 mmol/g für Cd, Ni und Zn das beste Biosorbens bis zu diesem Punkt der Arbeit darstellte. Das Gleichgewicht zwischen den in Lösung befindlichen Metallen und an der Alge gebundenen stellte sich bei C. salina und L. taylorii wiederum sehr schnell ein und war praktisch nach 30 min abgeschlossen. Die beiden Algen zeigten eine ähnliche pH-Abhängigkeit gegenüber den Metallen. So waren ab einem pH von 3 (pH 4 bei Ni an L. taylorii) bis pH 6 bzw. pH 5 bei Cu an L. taylorii die Beladungen für die Schwermetalle annähernd konstant. Sinkt der pH unter 3 so nimmt die Beladung für Cd, Cu, Ni, Pb und Zn deutlich ab. Die Metalle können nach einer Beladung bei saurem pH-Wert (0,1 N HCl) von den Algen desorbiert werden. Das Plateau im schwach sauren Bereich ist für beide Algen stärker ausgebildet als bei C. vulgaris und stellt eine wichtige Eigenschaft der untersuchten Algenbiosorbenzien dar. Kleine Schwankungen im pH-Wert bedingen somit kaum Änderungen der Beladungen, dies ist für die Anwendung der Biosorption auf reale Abwässer wichtig. Die hohe Reproduzierbarkeit der Biosorptionsuntersuchungen lässt sich dadurch ebenfalls erklären. Der Einsatz von Puffern ist deshalb nicht notwendig. Ein vergleichbaren Einfluss des pH-Wertes auf die Biosorption von Kupfer und Cadmium an der marinen Alge Durvillaea potatorum konnten Yu und Kaewsarn (1999) beobachten. Der Verlauf der pH-Kurven der Algen ist den Titrationskurven von schwachen Säuren sehr ähnlich. Der pKs-Wert der Carboxylgruppe liegt z.B. im Bereich von 4-5. Bei pH-Werten unter dem pKs-Wert sind die Carboxylgruppen protoniert und stehen als Bindungstellen nicht mehr zur Verfügung (s. Kap. 6.2). 110 Zusammenfassung und Diskussion Reale Abwässer stellen ein Gemisch aus verschiedenen Metallen dar. Die Betrachtung der Sorption in Hinblick auf Selektivitäten gegenüber den Schwermetallen ist deshalb von großer Bedeutung. Dazu wurde die Biosorption an den Algen in äquimolaren Mischungen aller betrachteten Metalle mit steigender Konzentration untersucht. An C. salina und L. taylorii zeigte sich, dass Pb bevorzugt gebunden wird und die anderen Metalle von den Bindungsstellen verdrängt. Cu wird an L. taylorii wiederum selektiv gegenüber Cd, Ni und Zn sorbiert und vom Pb erst im Sättigungsbereich an der Biosorption gehindert. Cd, Ni und Zn zeigen untereinander ebenfalls Selektivitäten, die aber nicht so dominant ausgebildet sind. An C. salina wird Cd bevorzugt vor Zn und Ni gebunden. An L. taylorii erfolgten aufgrund der starken Sorption von Pb und Cu weitere Versuche, um die Selektivitäten von Cd, Ni und Zn besser einschätzen zu können. Zn wird bevorzugt gebunden gefolgt von Cd und Ni. Ni wird am stärksten von den Bindungsstellen an C. salina und L. taylorii verdrängt und zeigte auch die geringsten Affinitäten zur Oberfläche bei allen untersuchten Algen in den Sorptionsisothermen. Neuere Arbeiten bestätigen die bevorzugte Bindung von Pb gegenüber den anderen Schwermetallen aus Mehrmetalllösungen. So beobachteten Singh et al. (2000) dieses Phänomen an Algen von Microcystis, Lemna und Spirogyra (Reihenfolge: Pb > Cu > Zn > Cd). Die Selektivitätsfolge für die anderen Metalle passt sehr gut mit den Ergebnissen von L. taylorii zusammen. Andere Biosorbenzien auf Basis der Bakterie Streptoverticillium cinnamoneum und dem Pilz Penicillium chrysogenum (Puranik und Paknikar, 1999), wie auch an dem Pilz Rhizopus arrhizus (Sag et al., 2000), zeigen ebenfalls eine hohe Präferenz für Pb gegenüber den anderen untersuchten Schwermetallen. Neben der Selektivität der Bindung der einzelnen Schwermetalle ist für eine Anwendung der Einfluss von anderen Metallkationen aus in Abwässern üblichen Fremdsalzen von Bedeutung. An L. taylorii wurde der Einfluss von Fremdsalzen am Beispiel vom einwertigen Na und zweiwertigen Ca gezeigt. Die Gehalte von Na und Ca erstreckten sich bis zu 20 g/L. An L. taylorii konnte eine größere Konkurrenz von Ca um die Sorptionsstellen für Pb, Cd, Ni und Zn verglichen mit Na festgestellt werden. Ein Einfluss der beiden Kationen auf die Biosorption von Cu an der Alge wurde nicht beobachtet. Pb, Cd, Ni und Zn zeigen wieder ein individuelles Verhalten gegenüber Ca und Na. Die Konkurrenz von Ca und Na beeinflusste die Bindung von Cd am stärksten. So verminderte sich die Beladung von Cd bei Na-Gehalten von 20 g/L in der Lösung um 60 % . Die gleichen Gehalte an Ca bewirkten, dass eine Biosorption von Cd an der Alge nicht mehr nachweisbar war. Bei der Reinigung von realen Abwässern sollte der entsprechende Gehalt an Fremdsalzen vor allem von Ca berücksichtigt werden. Biosorptionsuntersuchungen 111 Wilke (2001) zeigte, dass konventionelle Ionenaustauscher noch sehr viel empfindlicher gegenüber Ca und Na Ionen sind. Die vorangehend beschriebenen Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass neben individuellen Unterschieden in der Bindung der Metalle zwischen allen drei näher untersuchten Algen auch viele Gemeinsamkeiten festgestellt werden konnten. Die Metalle zeigen charakterisitsche Unterschiede in der Biosorption, die scheinbar unabhängig von der Algenspezies sind (z.B. Pb und Ni). Wie können die unterschiedlichen Biosorptioneigenschaften der einzelnen Metalle an den Algen erklärt werden? Betrachtet man die physiko-chemischen Eigenschaften der fünf Schwermetalle (s. Tab. 2–1) so erkennt man, dass vier der Schwermetalle in den Nebengruppen und ein Schwermetall das Pb in eine Hauptgruppe des Periodensystems eingeordnet werden. Unter Betrachtung der verschiedenen Ordnungszahlen der Elemente ergeben sich deutliche Unterschiede im Aufbau ihrer Elektronenhüllen, die für die Wechselwirkung mit den Bindungstellen an der Alge wichtig sind. Cu, Ni und Zn sind vom Aufbau der Elektronenhüllen am ähnlichsten. Die einzelnen Schwermetalle liegen in Lösung als Kationen vor und bevorzugen eine Wechselwirkung vor allem mit negativen geladenen Bindungsorten der Algenoberfläche. Unter Hinzunahme des Models nach Pearson (1963) können solche Reaktionen der Metalle an der Oberfläche der Alge als eine Säure-Base Reaktion verstanden werden. Die nach ihm benannte Säure-Base Theorie teilt Säuren und Basen in harte und weiche ein. Der Ausdruck hart bzw. weich beschreibt die Deformierbarkeit (Polarisierbarkeit) der Elektronenhülle der entsprechenden Atome. Danach wird Cd in die Gruppe der weichen Säuren und Pb, Ni, Cu und Zn zwischen den weichen und harten Säuren eingeteilt. Pb besitzt die „härtesten“ Eigenschaften von den vier Schwermetallen in der Mittelstellung. Harte Säuren reagieren bevorzugt mit harten Basen und analog weiche Säuren bevorzugt mit weichen Basen. Zu den harten Basen zählen z.B das Carboxylatanion und andere sauerstoffreiche Anionen. Die weichen Basen stellen eine Vielzahl von Anionen der Halogene und des Kohlenstoffs in Kombination mit den Heteroatomen S, P oder N (CN-, R-S-) dar. Zu den harten Säuren zählen neben dem Proton (stärkste Säure) auch die Metallkationen mit Edelgaskonfiguration wie das Na+und Ca2+-Ion. Beziehen wir die Erkenntnisse von Pearson nun auf die beobachteten Biosorptionseigenschaften an den Algen, so lassen sich einige Eigenschaften besser verstehen. Vor allem das Konkurrenzverhalten von Protonen und der Fremdionen Na+ und Ca2+ lassen sich gut mit Pearson erklären. Die pH-Kurven der Metalle und die Untersuchung zu den Bindungsstellen (s. Kap. 6.2) zeigen das schwach saure Gruppen, wie Carboxylgruppen, an der Biosorption entscheidend beteiligt sind. Sie stellen harte Basen dar und reagieren demnach bevorzugt mit harten Säuren. Die Desorption der Metalle mit Säuren beruht demnach auf der 112 Zusammenfassung und Diskussion größeren Affinität der Protonen zur harten Base verglichen mit den schwächeren Schwermetallen. Als weiteres Beispiel seien die Untersuchungen der Konkurrenz von Na und Ca bei der Bindung von Cd an L. taylorii angeführt. Cd wird von den untersuchten Metallen durch Naund Ca-Ionen am stärksten beeinflusst, was durch seine Einordnung als weiche Säure verständlich wird. Cd zeigt auch an C. vulgaris und L. taylorii die geringsten Beladungskapazitäten unter den Metallen. Die härtesten Säureeigenschaften zeigt Pb und nimmt auch in den Biosorptionsuntersuchungen die wichtigste Rolle ein. Der vorgestellte Ansatz kann natürlich nicht alle Fragen beantworten. So lässt sich die geringe Affinität von Ni zur Oberfläche der untersuchten Algen und der geringe Einfluss von Ca und Na auf die Biosorption von Cu an L. taylorii mit dem Modell nicht beschreiben. Bei Betrachtung der Komplexität der Algenoberfläche verwundert das auch nicht, es zeigt vielmehr, dass noch weitere Bindungsmechanismen bei der Biosorption eine entscheidene Rolle spielen müssen. Dem Projektbereich wurde ein reales Pb-Abwasser aus der Akkumulatorenindustrie zur Verfügung gestellt (cPb = 3 mg/L). L. taylorii konnte im Batchversuch 90 % der Metalle in Gegenwart von 0,8 g/L Ca aus dem Abwasser entfernen. Wilke (2001) konnte mit dem entwickelten Kolonnenverfahren auf Basis von immobilisierter L. taylorii das Abwasser bis unter den Grenzwert für Direkteinleiter aufreinigen (Ablauf < 0,4 mg/L Pb). Für eine Anwendung der Algen als Schwermetallbiosorber ist es notwendig, die Biomasse günstig - z.B. als Abfall einer biotechnologischen Produktionsanlage - zu beziehen. Die in dieser Arbeit im Mittelpunkt stehende L. taylorii wird gerade einem intensiven Wertstoffscreening unterzogen. Es ist aus der Sicht dieser Arbeit zu hoffen, dass dieses erfolgreich ist, weil für die industrielle Nutzung der Biosorption eine industrielle Produktion der Algen zur Wertstoffgewinnung zwingend erforderlich ist (Sandau et al., 1996; Bunke et al., 1999). 6.2 Charakterisierung der Bindungstellen Ausgehend von Arbeiten von Crist et al. (1992, 1994, 1999), die die Bedeutung von funktionellen Gruppen für die Biosorption von Al, Cd und Pb an der marinen Makroalge Vaucheria zeigten, wurden die Bindungstellen auf der Oberfläche der Algen charakterisiert. Träger der funktionellen Gruppen (z.B. Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfonsäure- und Aminogruppen) in der Zellwand der Algen sind vor allem Polysaccharide und in diese eingebettete Proteine (s. Kap. 2.2.3) (Kloareg und Quatrano, 1988). Die Gehalte an funktionellen Gruppen der im Screening eingesetzten Algen, die sich aus den Heteroatomen N, S und P zusammensetzen, wurden durch eine Elementaranalyse abgeschätzt. Charakterisierung der Bindungstellen 113 Ein direkter Zusammenhang zwischen den Gehalten an Heteroatomen und den Biosorptionseigenschaften konnten nicht gefunden werden. Mit Schwefelgehalten von 0,02 - 0,3 mmol/g Biomasse spielen schwefelhaltige Bindungsstellen nur eine untergeordnete Rolle. Die höchsten Schwefelgehalte wurden übrigens bei der Bangiophycea P. purpureum ermittelt, deren Zellwände sich zum Teil aus Galactanen (Polysaccharide aus Galactose mit Sulfatestergruppen) zusammensetzen (Kloareg und Quatrano, 1988). L. taylorii besitzt von den untersuchten Algen einen der geringsten Gehalte an einzelnen Heteroatomen. Die Bedeutung der Carboxylgruppen für die Biosorption der Schwermetalle konnte durch ihre Methylierung nach der Methode von Gardea-Torresdey et al. (1990) belegt werden. Zur Methylierung wurden Algen mit verschiedenen Biosorptionseigenschaften ausgewählt. Die modifizierten Biomassen zeigten alle eine deutlich verringerte Biosorption für Pb, Cd, Ni und Zn (bis zu 90 % der ursprünglichen Beladung). Die Bestimmung der Carboxylgruppengehalte erfolgte nach Hydrolyse der Methylester mit Natronlauge über die Analyse des freigesetzten Methanols. Die Gehalte an Carboxylgruppen lagen im Bereich von 0,3 mmol/g bei C. spezies bis 0,9 mmol/g bei L. taylorii. Der Carboxylgruppengehalt von C. salina war mit 0,8 mmol/g ähnlich zu L. taylorii. Die Untersuchungen der unbehandelten Algen ergab, dass die Carboxylgruppen bei den Algen quasi frei vorliegen. Die Ergebnisse bestätigten die beobachteten pH-Abhängigkeiten der Metalle im vorigen Abschnitt (s. Kap. 6.1), die ein Vorhandensein von schwach sauren Bindungstellen für die Algen zeigten. Umfangreiche Untersuchungen zur Entfernung von Cd und Pb aus wässrigen Lösungen mit der Alge Saragassum fluitans (Fourest und Volesky, 1996) und Cu, Sr, Cd und Pb mit der Pflanze Datura innoxia (Lin und Rayson, 1998; Drake et al., 1996) ebenfalls aus wässrigen Lösungen bestätigten die Bedeutung der Carboxylgruppen in den Zellwandpolymeren für die Biosorption. Fehrmann et al. (1993) fanden bei ihren Untersuchungen zur Biosorption von Cd an 12 Algenspezies Carboxylgruppengehalte im Bereich von 0,1 - 0,4 mmol/g Biomasse. Romero-Gonzalez et al. (2001) konnten durch Veresterungsversuche an Abfallbiomasse von marinen Makroalgen nachweisen, dass für die Bindung von Cd an der Biomasse Carboxylgruppen entscheidend beteiligt sind. In den Algen C. vulgaris und S. platensis konnten ähnlich hohe Carboxylgruppengehalte bestimmt werden wie bei den leistungsfähigsten Algen. C. vulgaris und S. platensis zeigen aber deutlich schwächere Biosorptionsleistungen, was zeigt, das weitere Faktoren die Biosorption beeinflussen. Holan et al. (1993) wiesen darauf hin, dass für die Bindung der Metalle die sterische Anordnung der Hydroxylgruppen im Polysaccharid entscheidend sein kann. Das gilt natürlich auch für die Anordnung der funktionellen Gruppen in den Polymeren der Zellwände. So kann erst die Aufklärung der räumlichen Anordnung der funktionellen 114 Zusammenfassung und Diskussion Gruppen in der Zellwand einen Aufschluß über die tatsächliche Verfügbarkeit dieser als Bindungsstelle für die Metalle geben. Die Carboxylgruppen sind hauptsächlich Bestandteile der sauren Polysaccharide (Polyuronsäuren, s. Abb. 2–1) der Algenzellwand, die bei einer Vielzahl von Algenarten gefunden wurden (Kloareg und Quatrano, 1988; Hoek et al., 1995). Die sauren Monomere dieser Polysaccharide stellen die sogenannten Uronsäuren dar (z.B. Galacturonsäure und Glucuronsäure). Zur Charakterisierung der Polysaccharide der Zellwände wurden an ausgewählten Algen nach saurer Hydrolyse die Monosaccharide mittels HPAEC-PAD Chromatographie analysiert. Neben den üblichen neutralen Monosacchariden wurde die Gehalte an den Uronsäuren Galacturon- und Glucuronsäure bestimmt. Churms (1991), Martens und Frankenberger (1991) und Wunschel et al. (1997) stellten in ihren Arbeiten die Vorteile der HPLC mit Anionenaustauschersäulen und PAD- oder MS-Detektion speziell für die Untersuchung von Kohlenhydraten in biologischen Proben heraus, weil die Analyse von Uronsäuren in einem Schritt mit neutralen Monosacchariden möglich ist. Die untersuchten Algen waren wiederum nach ihren unterschiedlichen Biosorptionseigenschaften ausgewählt. An den mit der etablierten Methode untersuchten Zellwänden wurden Monosaccharidgehalte zwischen 12 % bei C. salina und 74 % bei P. purpureum ermittelt. Die Uronsäuregehalte bewegten sich in einem Bereich von 0,2 % (0,01 mmol/g) bei G. veruscosa bis 4,2 % (0,2 mmol/g) bei P. purpureum. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der analysierten Monosacchariden und den Biosorptionseigenschaften konnte nicht festgestellt werden. Die ermittelten Uronsäuregehalte können die hohen Beladungen für die Metalle nicht erklären. Die in der Arbeit verwendeten Hydrolysebedingungen wurden von Blaschek (1991) empfohlen für die Untersuchung von sauren Polysacchariden. Stärkere Hydrolysebedingungen würden zu einer Decarboxylierung der Uronsäuren führen und somit eine Analyse verhindern. Eine Vielzahl von Untersuchungen bestätigen diesen Ansatz (Ray und Lahaye, 1995; Becker et al., 1995; Falshaw und Furneaux, 1994). Die großen Unterschiede in den Gesamtkohlenhydratgehalten lassen sich somit durch unterschiedliche Gehalte an sehr hydrolysestabilen Polysacchariden (z.B. Cellulose), die bei den angewandten Hydrolysebedingungen nicht gespalten werden, erklären. Die Analyse von P. purpureum bestätigt die hohen Gehalte an leicht hydrolysierbaren Schleimpolysacchariden in der Zellwand der Alge, die in der Literatur für eine Vielzahl von Arten dieser Abteilung (Rotalgen) beschrieben wurden (Geresh et al., 1992; Miller et al., 1995; Chiovitti et al., 1995). Die Alge war speziell aufgrund dieser Daten zum Screening ausgesucht worden. Die Analyse der Gesamtheit der Zellwandpolysaccharide ist ein äußerst komplizierter Vorgang, der eine Kombination von nasschemischen und vor allem auch spektroskopischen Verfahren erforderlich macht Charakterisierung der Bindungstellen 115 schen und vor allem auch spektroskopischen Verfahren erforderlich macht (Falshaw und Furneaux, 1998) und den Rahmen dieser Arbeit gesprengt hätte. Um die Bindungsstellen an den Algenzellwänden weiter eingrenzen zu können, wurden verschiedene Extraktionen an C. salina und L. taylorii durchgeführt. Es erfolgten lipophile, alkalische und hydrophile (100 °C) Extraktionen, mit denen jeweils verschiedene Zellwandbestanteile extrahiert wurden. Nach den unterschiedlichen Behandlungen zeigten die Beladungen für Pb und Zn für die beiden Algen deutliche Unterschiede. Mit der alkalischen Extraktion konnte an C. salina und L. taylorii mit bis zu 60 % der Biomasse der größte Anteil extrahiert werden. Die Beladungen für die Metalle sanken dementsprechend für C. salina um über 65 % für Pb und 48 % für Zn ab (Abnahme bezogen auf die ursprüngliche Biomasse). Dahingegen nahmen die Beladungen für Pb und Zn an L. taylorii nur um 20 % ab. Die alkalisch extrahierten Zellwandbestandteile von L. taylorii (Proteine, Polysaccharide und Hemicellulosen) besitzen somit nur eine geringe Anzahl an Bindungstellen für die Metalle. An C. salina und L. taylorii zeigen die lipophilen Extraktionen die geringsten Auswirkungen auf die Biosorption. Die hydrophilen Extraktionen bei 100 °C an den beiden Algen verringern die Kapazitäten um bis zu 30 % für die Schwermetalle. Die Mehrzahl der Bindungstellen an L. taylorii (70%) sind auf den nicht extrahierbaren Zellwandbestandteilen lokalisiert. Fehrmann (1993) beschreibt bei seinen Untersuchungen an der Phaeophyceae Ectocarpus siliculosus, dass die Bindungstellen für Cd zum großen Teil im Zellwandgerüst der Biomasse lokalisiert sind. Untersuchungen an der Chlorophyceae Chlorella regularis von Nakajima et al. (1981) belegen den großen Einfluß der Zellwandbestandteile, die durch eine basische Extraktion entfernt werden konnten, auf die Biosorption. Eine alkalische Behandlung der Zellwände von Chlorella regularis führte zu einer Abnahme der Beladungen mit Cu von 48 % und mit Cd von 70 %. Die lipophilen Extraktionen zeigten ebenfalls den geringsten Einfluss auf die Biosorption der verbleibenden Biomasse. Die Ergebnisse an C. salina und L. taylorii zeigen deutlich, daß die Bindungstellen an beiden Algen an ganz verschiedenen Zellwandbestandteilen lokalisiert sind. Die Kenntnis des Einflusses der verschiedenen Extraktionsverfahren auf die Biosorptionseigenschaften der Algen ist auch aus Sicht der technischen Nutzung von Abfallbiomasse als Biosorbens von großer Wichtigkeit, weil solche Extraktionen in der Naturstoffisolierung aus Algen häufig angewendet werden. Die extrahierten Biomassen von C. salina zeigten nach den verschieden Behandlungen ähnliche Beladungen wie die ursprüngliche Alge. Die behandelte Alge L. taylorii hatte sogar bis um einen Faktor 2 bessere Beladungen bezogen auf die verbleibende Biomasse, da 116 Zusammenfassung und Diskussion der Einfluss der extrahierten Zellwandpolymere deutlich geringer war. Somit wären beide Algen nach einer Wertstoffisolierung noch hervoragende Biosorbenzien. Zur Charakterisierung von Polysacchariden, wie auch komplexen Zellwandoberflächen, bedient man sich einer Vielzahl von spektroskopischen Methoden, um weitere Information über die Strukturen der Oberflächen zu erhalten. Zur Untersuchung der beiden Algen wurden die Rasterelektronenmikroskopie (REM) in Kombination mit einer Röntgenmikroanalyse und die FT-IR Spektroskopie eingesetzt. Die REM mit Röntgenanalyse erlaubte die Betrachtung der Oberflächen der Biosorbenzien bei gleichzeitiger Analyse der vorhandenen Elemente auf den Algen. Gerade diese Kombination macht die Methode so interessant für Biosorptionsuntersuchung, was eine Reihe von Arbeiten in der neueren Literatur belegen (Tsezos et al., 1997; Yu et al., 2000; Suh et al., 1999; Figueira et al., 1999). Mit REM und Röntgenanalyse konnten die an C. salina und L. taylorii gebundenen Metalle Pb, Cd, Ni und Zn auf der Oberfläche nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Verteilung der Metalle auf der Oberfläche der Alge ergaben, das die Metalle sehr gleichmäßig über die untersuchte Oberfläche verteilt waren. Die gemessenen hohen Kapazitäten für die Metalle stehen im Einklang mit dieser Beobachtung. Aus den Röntgenspektren vor allem der unbeladenen Alge L. taylorii wurden überraschend hohe Gehalte an Calzium auf der Oberfläche abgeleitet. Da die Algen vor den Untersuchungen gründlich gewaschen worden waren und somit eine Kontamination ausgeschlossen werden konnte, muss das Calzium auf der Alge spezifisch gebunden vorliegen. Diese Deutung wurde durch das Röntgenspektrum der mit Pb beladenen Alge bestätigt, das deutlich geringere Ca-Gehalte aufwies. Erneute Untersuchungen der Biosorption von Cd, Ni, Pb und Zn an L. taylorii in Hinblick auf Calzium in der Lösung ergaben, dass die Metalle im direkten Austausch mit Ca an die Alge gebunden werden. Die Versuche belegen die Befunde, die aus den Röntgenspektren abgeleitet wurden. Ein Vergleich zwischen den gebundenen Metallen und dem ausgetauchten Calziumionen zeigt, dass ein Ionenaustauschprozess an L. taylorii der Hauptmechanismus bei der Biosorption darstellt. Somit konnte hier auf direkte Weise ein Ionenaustauschvorgang nachgewiesen werden. Die von Crist et al. (1994) beschriebenen Ionenaustauschvorgänge bei der Biosorption an Vaucheria konnten somit auch für L. taylorii bestätigt werden. Die erzielten Ergebnisse aus den vorherigen Betrachtungen zeigen die Bedeutung von schwach sauren funktionellen Gruppen, wie den Carboxylgruppen, für die Biosorption der Metalle an den beiden Algen. Zur Identifizierung von funktionellen Gruppen in komplexen Molekülen wie Polysacchariden eignet sich besonders die FT-IR Spektroskopie (Sene et al., Modifizierung der Biomasse 117 1994; Kamnev et al., 1997; Coimbra et al., 1999). Die Spektren von C. salina und L. taylorii sind sehr ähnlich und aufgrund einer Vielzahl von Kombinationsschwingungen schwer zu interpretieren. Beide Spektren zeigen jedoch die charakteristischen Schwingungen der Carboxylgruppe (Schwingung der Carbonylfunktion und des Carboxylatanions) sehr deutlich. Vergleichbare FT-IR Spektren mit Adsorptionsbanden der Carboxylgruppe wurden an zwei Algenspezies der Klasse der Chlorophyceae von Kiefer et al. (1997) und an Zellwänden mariner Makroalgen (Romero-Gonzales et al., 2001) beobachtet. Die spezifischen Oberflächen wurden für L. taylorii mit 4 m2/g und für C. salina mit 15 m2/g ermittelt. Die spezifischen Oberflächen der beiden Algen sind im Verhältnis zu anderen kommerziellen Adsorbenzien viel geringer, Aktivkohle besitzt Oberflächen von 300 bis 1800 m2/g oder Adsorberpolymere von 100 bis 1500 m2/g (Dorfner, 1991). Die maximalen Beladungen für Pb, Cd, Ni und Zn bezogen auf die Oberfläche errechneten sich für L. taylorii von 0,09 mmol Cd / m2 bis 0,37 mmol Pb / m2 und für C. salina von 0,04 mmol Ni / m2 bis 0,13 mmol Pb / m2. 6.3 Modifizierung der Biomasse Das Potential der Einführung von ionenaustauschaktiven Gruppen in die Zelloberfläche der Algen soll im folgenden abschließend diskutiert werden. Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Kenntnis aus umfangreichen Arbeiten zum Einbau von Carboxylgruppen und Phosphatgruppen in die Biopolymere von Holz und Chitin, die zu Produkten mit hohen Bindungskapazitäten für verschiedene Metalle führte (Meisch und Gauer, 1998). Die angewandten Synthesen sollten so gestaltet sein, dass sie für die Überführung in den industriellen Maßstab geeignet sind. An den beiden Algen C. salina und L. taylorii wurden verschieden Verfahren getestet. Die Versuche machten deutlich, dass es große Unterschiede unter den beiden Algen gibt. Die eingesetzten Methoden führten zum Teil zu hohen Verlusten an Biomasse, da unter den gewählten Bedingungen die Polysaccharide stark hydrolysierten. Die Einführung von Carboxylgruppen an L. taylorii und Phosphorylierungen an C. salina zeigten deshalb schlechte Ausbeuten und zum Teil kaum Effekte auf die Beladungen. Im Gegensatz dazu stehen die Phosphorylierungen an L. taylorii unter Verwendung von Phosphorylchlorid und vor allem von Phosphorsäure. Die Phosphorylierung nach Gauer (1996) der freien OH-Gruppen mit Phosphorsäure in einer Harnstoffschmelze führte zu einem Anstieg des P-Gehaltes von 0,5 mmol/g P der unbehandelten L. taylorii auf 4,4 mmol/g P der phosphorylierten Alge. Der Anstieg der P-Gehalte bewirkte eine enorme Erhöhung der Bindungskapazitäten für Cd (Faktor 6), Ni (Faktor 4,6), Pb (Faktor 2) und Zn (Faktor 5,5). Die Synthesebedingungen wurden für 118 Zusammenfassung und Diskussion L. taylorii hinsichtlich Ausbeute, Einbau von Phosphatgruppen und der Beladungskapazität für Pb optimiert. Wie kommt es zur Phosphorylierung der OH-Gruppen? In Abb. 6–2 ist der von Dau et al. (1954) für die Phosphorylierung mit Phosphorsäure in einer Harnstoffschmelze vorgeschlagene Reaktionsverlauf dargestellt. Die Reaktion beruht im Prinzip auf eine Veresterung der primären Hydroxylgruppen der Zellwandpolymere mit Phosphorsäure. Der zugesetzte Harnstoff im Überschuss diente dabei sowohl als Protonenakzeptor sowie auch als wasserfreies Medium während der Reaktion. Der Harnstoff pufferte die hydrolytische Wirkung der Säurekomponente ab und verschob andererseits das Reaktionsgleichgewicht durch Verbrauch des bei der Veresterung entstehenden Wassers zur Seite der Produkte. Die Entstehung der gasförmigen Reaktionsprodukte Ammoniak und Kohlendioxid begünstigte diese Verschiebung des Gleichgewichtes zusätzlich. Abb. 6–2: Reaktionsgleichung nach Daul et al. (1954) für die Phosphorylierung der OHGruppen Die Entstehung der Gase bewirkte zudem ein starkes Aufschäumen des Reaktionsgemisches, was eine gute Homogenisierung bedingte und somit zu einer gleichmäßigen Phosphorylierung von L. taylorii führte. Die hohe Reproduzierbarkeit der Biosorptionsuntersuchungen bestätigt diese Vermutung. Die Optimierung der Reaktionsbedingungen erlaubte einen tieferen Einblick in die Reaktionsmechanismen. Bemerkenswert waren die guten Korrelationen zwischen den Gehalten an Phosphor und den erzielten Bleibeladungen. Die Versuche zum Einfluß der Reaktionszeit bei 170 °C zeigten, dass zu Beginn der Reaktion (nach der Vorbehandlung) etwa die Hälfte der Biomasse durch die Phosphorsäure hydrolysiert wurde. Im Verlauf der Reaktion nahmen die Ausbeuten aufgrund des Einbaus der Phosphatgruppen und erneuter Polymerbildung wieder Modifizierung der Biomasse 119 zu. Die Zunahme der Ausbeuten, obwohl die Phosphorgehalte und die Bleibeladung konstant bleiben, konnte auch bei steigenden Reaktionstemperaturen beobachtet werden. Ein Anstieg der Temperaturen von 170 °C auf 200 °C ließ die Ausbeuten von 99 % auf 140 % ansteigen. Die Erhöhungen der Ausbeuten lassen sich z.B. damit erklären, dass unter diesen Bedingungen vermehrt Polyphosphate gebildet werden, die entweder untereinander oder mit benachbarten Polysaccharidketten Verzweigungen bilden. Die Reaktionsoptimierung der Ausgangsstoffe ergab eine Harnstoffkonzentration von 74 mmol/g Alge und eine Phosphorsäurekonzentration von 18 mmol/g Alge als optimal. Um für den Projektbereich in kurzer Zeit ausreichend modifizierte Biomasse produzieren zu können, wurde der Ansatz auf 5 g Biomasse unter den optimierten Bedingungen erhöht. In dieser Arbeit wurden insgesamt über 50 g der modifizierten L. taylorii mit reproduzierbaren Beladungen für den Projektbereich hergestellt. Die eingebauten Bindungstellen wurden durch FT-IR Spektroskopie und REM – Röntgenmikroanalyse charakterisiert. Es zeigte sich, daß die FT-IR Spektroskopie zur Charakterisierung von komplexen Oberflächen hinsichtlich funktioneller Gruppen wieder sehr gut eingesetzt werden konnte. Im IR-Spektrum der phosphorylierten L. taylorii waren die typischen Schwingungen (P=O und P-O-H) klar zu identifizieren. Wie sehen nun die Biosorptionseigenschaften der neuen phosphorylierten L. taylorii im Vergleich zu der nartürlichen Alge aus? Die in Kap. 6.1 untersuchten Eigenschaften an L. taylorii waren auch für L. taylorii phos. Gegenstand der Versuche. Die Adsorptionsisothermen von Cd, Cu, Ni, Pb und Zn an der Biomasse zeigen hervoragende Beladungen. Die quantitative Beschreibung der Isothermen erfolgte erneut nach dem Modell von Langmuir und ergab eine sehr gute Anpassung (r2 > 0,999) der experimentellen Daten mit dem Verlauf der Adsorptionskurven. Die Berechnung der maximalen Beladungen ergab Werte von 2,5 mmol Cd; 2,4 mmol Cu; 2,8 mmol Ni; 3,1 mmol Pb und 2,6 mmol Zn pro g Biotrockenmasse (Pb > Ni > Zn > Cd > Cu). Die erreichten Beladungen stellen die höchsten in dieser Arbeit beobachteten Beladungen dar. Pb zeigt wie auch für L. taylorii eine höhere Beladung, jedoch sind die Abstände der Isothermen zueinander deutlich verringert. Die Bindungskapazitäten der fünf Metalle an der modifizierten L. taylorii sind mit den besten kommerziell erhältlichen Ionenaustauschern vergleichbar (Dorfner, 1991). Insgesamt ist die Affinität (Langmuirkonstante) aller Metalle zur Oberfläche der Alge im Vergleich mit der unbehandelten L. taylorii wesentlich erhöht. Die Affinitätsreihenfolge ergab Zn > Pb > Cd ≥ Cu > Ni, sie ist identisch mit der der unbehandelten Alge. Wie auch bei anderen Algenbiosorbenzien zeigt Ni die geringste Affinität unter den betrachteten Metallen. Die gegebene Interpretation in Kap. 6.1 ist auch auf die 120 Zusammenfassung und Diskussion modifizierte Biomasse anwendbar. Die Phosphatgruppe wird ebenfalls zu den „harten Basen“ nach Pearson gezählt und reagiert bevorzugt mit „harten Säure“. Die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Metallen in Lösung und den Metallen an der neuen Biomasse gebundenen ist bereits nach wenigen Minuten im Batchversuch abgeschlossen. Die bedeutenste Änderung zur unbehandelten Alge konnte bei der pH-Abhängigkeit der Biosorption der Metalle an L. taylorii phos. beobachtet werden. Über den gesamten pH-Bereich (pH 1 bis 6) waren hohe Beladungen bestimmt worden. Eine Erniedrigung der Beladungen ab pH 3 war für Cd, Ni und Cu zwar zu beobachten, jedoch war die Abnahme nicht mit der von L. taylorii zu vergleichen. Die größte Abnahme der Beladung zeigte Cu um 55 % bei pH 1. Die Biosorption für Zn war praktisch konstant über den gewählten pH-Bereich. Der Einbau der Phosphatgruppe erklärt die Beobachtungen, da sich der erste pKs-Wert der Phosphorsäure bei pH 2 befindet und somit eine Protonierung der ionenaustauschenden Gruppe erst bei niedrigen pH-Werten einsetzt, in Gegensatz zu den schwach sauren Carboxylgruppen an L. taylorii. Die pH-Eigenschaften von L. taylorii phos. ließen Probleme bei der Desorption unter den üblichen Bedingungen von pH 1 erwarten. So war eine Desorption der Metalle mit einer 0,1 N HCl nicht möglich. Erst mit Verwendung einer 3 N HCl konnten die Metalle von der Biomasse entfernt werden. Wegen der harten Reaktionsbedingungen bei der Synthese stellen die härteren Desorptionsbedingungen für das Biosorbens keine Gefahr einer Zerstörung dar. Diese Ergebnisse sind für eine praktische Anwendung sehr günstig, weil dieses neue Biosorbens auch für die Reinigung von Abwässern mit niedrigen pH-Werten einsetzbar ist, ohne dass ein vorhergehender Neutralisationsschritt durchgeführt werden müsste. Der Anwendungsbereich des Biosorbens hat sich somit deutlich erweitert. Die Frage nach den Selektivitäten der neuen Bindungstellen für die einzelnen Metalle steht im Mittelpunkt der folgenden Ausführungen. Wie im vorigen Abschnitt gezeigt, führten die Phosphorylierung der Biomasse zu veränderten Eigenschaften in Bezug auf den pH-Wert. Die Selektivitätsuntersuchungen mit den fünf Metallen ergaben keine wesentlichen Änderungen zu der nartürlichen Alge. Untersuchungen mit äquimolaren Lösungen aller fünf Metalle zeigten deutlich, dass Pb selektiv gebunden wird und alle anderen Metalle von den Bindungsstellen verdrängt. Es konnte ebenfalls beobachtet werden, dass die Beladungen von Pb, Cd und Zn bis zu einer Konzentration von 3 mmol/L gemeinsam ansteigen und mit der beginnenden Sättigung der Bindungsstellen von Pb verdrängt werden. Eine ausgeprägte Konkurrenz von Modifizierung der Biomasse 121 Cd, Cu und Zn untereinander konnten nicht beobachtet werden. Wie auch bei C. salina und L. taylorii bestimmt, ist die Affinität für Ni am geringsten. Abschließend wurde an dem Biosorbens L. taylorii phos. der für eine Anwendung wichtige Einfluss von Fremdsalzen auf die Biosorption der Metalle betrachtet. Es stellten sich wiederum viele Gemeinsamkeiten mit der unbehandelten Alge heraus. So hatte Ca eine größeren Einfluss auf die Beladungen mit den Metallen als das einwertige Na-Ion. Die Bindungen von Cu und Zn wurden am geringsten von beiden Fremdionen beeinflusst. Mit einer Abnahme der Kapazität für Pb von fast 70 % bei Anwesenheit von 20 g/L Na erwies sich dieses Schwermetall als besonders empfindlich gegenüber steigenden Na-Konzentrationen. Mit Beladungen von über 1 mmol/g für Cd, Ni und Pb bzw. von 2 mmol/g für Cu und Zn bei 20 g/L Na in der Lösung besaß das Biosorbens immer noch beachtliche Bindungskapazitäten. Erhöhte Konzentrationen von Ca führten dagegen bei den Metallen mit Ausnahme von Pb zu einer stärkeren Beeinflussung der Beladungen verglichen mit Na. Die Bindung von Ni und Zn wurde bei höheren Ca-Konzentrationen (4 - 18 g/L) auf über 90 % der ursprünglichen Beladung erniedrigt. Die Beladung von Cu wurde bis auf 53 % durch die Anwesenheit von Ca abgesenkt und damit am wenigsten von Ca beeinflusst. In der Literatur finden sich bisher nur wenige Studien über die Beeinflussung der Biosorption von Metallen an Mikroorganismen durch einen gezielten Einbau von zusätzlichen funktionellen Gruppen in die Zellwandpolymere. An dieser Stelle sei auf die Arbeit von Kraemer und Meisch (1999) verwiesen, die zeigten, dass durch die Einführung von zusätzlichen Carboxylund Ethyldiamingruppen in die Zellwandstrukturen des Pilzes Aspergillus niger eine Erhöhung der Bindungskapazitäten für Cd, Co, Ni und Zn erzielt werden konnte. Die vielen gemeinsamen Eigenschaften unter den untersuchten Algen, wie auch mit der modifizierten Biomasse, zeigen, dass es universelle Eigenschaften (Bindungskapazitätsreihenfolge, Affinitäten, Selektivitäten) gibt, die von den Bindungstellen größtenteils unabhängig sind und hauptsächlich von den Eigenschaften der Metalle geprägt werden. Dadurch wird auch verständlich, dass eine Vielzahl von Biosorptionsstudien in der Literatur, die an den unterschiedlichsten Biosorbenzien durchgeführt wurden, zu so ähnlichen Ergebnissen kommen. 122 7 Ausblick Ausblick Die Screeninguntersuchungen demonstrierten eine große Bandbreite in den Biosorptionsleistungen der einzelnen Algenarten. Es ist daher zu erwarten, das es noch eine Vielzahl unbekannter Arten gibt, die sehr interessante Eigenschaften hinsichtlich ihrer Metallbindungsfähigkeiten aufweisen. Deshalb sollten zukünftigen Biosorptionsuntersuchungen immer ein Screening vorausgehen bzw. die Arbeiten begleiten. Für eine Anwendung der Algen als Schwermetallbiosorber ist es notwendig die Biomasse günstig z.B. als Abfall einer biotechnologischen Produktionsanlage zu beziehen. Die Suche nach neuen Wirkstoffen für die pharmazeutische und kosmetische Industrie aus Algen wird heute in der Forschung immer bedeutender. Eine Vielzahl der hier untersuchten Algenspezies wird zur Zeit einem solchem Wirkstoffscreening unterzogen, deshalb sind die Aussichten für eine praktische Verwertbarkeit der hier vorgelegten Ergebnisse günstig. Die Bindung der Metalle an der Oberfläche der Algen stellt sich als ein sehr komplexer Vorgang dar. Die Erfahrungen zeigen, daß zur exakten Lokalisierung der Bindungsstellen und der Art der Bindung der Metalle eine Vielzahl verschiedener Methoden eingesetzt werden sollten. Zerstörungsfreie Untersuchungsmethoden, wie spektroskopische Methoden, die die Bindungszustände der Metalle auf der Oberfläche direkt beobachten können, spielen in diesem Zusammenhang eine sehr wichtige Rolle. In aktuellen Arbeiten erwies sich die Röntgenabsorptionsspektroskopie als eine besonders geeignete Methode, um die Art der Bindung und der beteiligten funktionellen Gruppen besser abschätzen zu können. In Deutschland wird mit der Inbetriebnahme von Bessy II in Berlin diese leistungsfähige Methode der Forschung zur Verfügung stehen. Das Potential der Einführung von ionenaustauschaktiven Gruppen in die Zelloberfläche der Algen konnte in der Arbeit gezeigt werden. Die Untersuchungen an den zwei ausgewählten Algen machten deutlich, dass es für alle Spezies keine generell anwendbare Modifizierungsmethode geben wird. Die Unterschiede der Zellwände macht eine Optimierung für jeden Organismus nötig. Die Suche nach weiteren Möglichkeiten für den Einbau von funktionellen Gruppen ist erforderlich, um die Effizienz der Modifizierung und die Ausbeute weiter zu erhöhen. Die angewandten Synthesen sollten immer so gestaltet sein, dass sie für die Überführung in den industriellen Maßstab geeignet sind. Literatur 8 123 Literatur Aksu, Z. (2001): Equilibrium and kinetic modelling of cadmium(II) biosorption by C. vulgaris in a batch system: effect of temperature. Sep. Pur. 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A–1: Geräteparameter der GF-AAS Spezifikation GF-AAS AAS4 mit Graphitrohrofen EA4 und Mikropipettiereinheit (MPE) - Analytik Jena, Jena Strahlungsquellen Hohlkathodenlampen (HKL) für Cd, Cu, Ni, Pb und Zn - Analytik Jena, Jena Untergrundkorrektur Deuteriumlampe (D2-Lampe) Strahlungsmodus Einstrahlbetrieb (abwechselnd HKL und D2Lampe) Messung der spezifischen Absorption Graphitrohre pyrolytisch beschichtet - Analytik Jena, Jena Schutzgas Argon Datenaufnahme PC – AAS 4, Ver. 1.11 Peakauswertung Flächenintegration V - Probe bzw. Standard im Graphitrohr 25 µl Probengefäße PP, Analytik Jena, Jena Tab. A–2: Element Cd Parameter des optischen Systems des GF-AAS Arbeitsbereich Wellenlänge (nm) Spaltbreite (mm) Lampenstrom (mA) ppb 228,8 0,2 5,5 ppm 326,1 0,2 3,5 ppb 324,8 0,4 4,5 ppm 222,6 0,4 6,5 ppb 232,0 0,15 5 ppm 303,8 0,15 8 ppb 283,3 0,2 5 ppm 261,4 0,2 5 Zn ppb 213,9 0,35 5,5 Zn ppm 307,6 0,35 6 Cu Ni Pb 134 Anhang - Metallanalytik Tab. A–3: Temperaturprogramme für die Metalle Schritta 35 2,2 250 50 10 2,2 1200 1500 3 0 200 1500 4 2,2 Trocknung 120 6 35 2,2 1030 250 7 2,2 2200 1500 4 0 2700 1500 5 2,2 Trocknung 120 6 35 2,2 Vorbehandlung 1000 220 6 2,2 Atomisierung 2500 1500 4 0 Reinigung 2900 1500 4 2,2 Trocknung 120 6 35 2,2 Vorbehandlung 500 100 6 2,2 Atomisierung 1500 1500 3 0 Reinigung 2000 1500 3 2,2 Trocknung 120 6 35 2,2 Vorbehandlung 500 73 6 2,2 Atomisierung 2000 1500 2 0 Reinigung b 6 Reinigung a 120 Atomisierung Zn Trocknung Vorbehandlung Pb vGase (L / min) Reinigung Ni td (s) Atomisierung Cu vTc (°C / s) Vorbehandlung Cd TEndb (°C) 2500 1500 4 2,2 Nullabgleich: 3 s vor Beginn der Messung; Messbeginn (s): Cd - 0,3; Cu - 0,6; Ni – 0,1; Pb – 0,5; Zn – 0,8 vor Beginn der Atomisierung Endtemperatur ; c Erhitzungsgeschwindigkeit; d Haltezeit; e Gasfluss 135 Anhang - Metallanalytik Tab. A–4: Parameter des Mikrowellenaufschlusssystem Spezifikation Mikrowellenofen MLS 1200 Mega – MLS GmbH, Leutkirch Drucksensor APC-35/80 Rotor Segmentrotor HPR-1000/10 Probengefäße HPS 100/110 Behältern (max. 100 bar) mit 35 ml PFA-C Einsätze Tab. A–5: Aufschlussprogramm der Algenbiomasse Schritt t (min) Pa (W) pmaxb (bar) 1 2 250 20 2 1 0 20 3 5 400 20 4 10 600 20 4 500 20 5c a c b Mikrowellenleistung; maximal erlaubter Druck im Aufschlussbehälter (Kontrolle durch Drucksensor) nach Schritt 5 folgt eine 15 min Abkühlungsphase Tab. A–6: Geräteparameter des Flammenphotometers Spezifikation Flammenphotometer M6D; Dr. Lange GmbH, Düsseldorf Interferenzfilter Calzium 136 Tab. A–7: Anhang - Metallanalytik Chemikalien und Materialien – Anhang A Produkt Standardlösungen: Blei Cadmium Calzium Kupfer Natrium Nickel Zink Spezifikation, Hersteller 1 g/l, in 0,5 M HNO3; Merck Eurolab, Darmstadt Salpetersäure 65%, suprapur; Merck Eurolab, Darmstadt Argon 5.0 99,999 %; Messer, Berlin Maßkolben PP; Roth, Karlsruhe Wasserstoffperoxid 30%, zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt Wasser millipore; TU Berlin Anhang - Biosorptionsuntersuchungen B 137 Biosorptionsuntersuchungen Tab. B–1: Chemikalien, Materialien und Geräte – Anhang B Produkt Spezifikation, Hersteller Chemikalien Metalle: Cadmiumchlorid Bleinitrat Kupfer(II)chlorid-2-hydrat Nickelchlorid-6-hydrat Zinkchlorid sonstige: Calciumchlorid Kaliumchlorid Natriumchlorid Salzsäure Natriumhydroxid Wasser zur Analyse; Sigma-Aldrich, Deisendorf zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt 30 %, suprapur; Merck Eurolab, Darmstadt zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt millipore; TU Berlin Materialien Maßkolben pH-Indikatorstäbchen Siebe und Siebvorrichtung Zentrifugenröhrchen Polypropylen; Roth, Karlsruhe Acilit (pH 0-6), Neutralit (pH 5-10); Merck Eurolab, Darmstadt Mikrosiebsatz; neolab, Heidelberg Polycarbonat, 10, 30, 80 mL, Nalge; Merck Eurolab, Darmstadt Geräte Gefriertrocknung Labormühle Leitfähigkeitsmessgerät Mörser pH Elektrode pH Meter Überkopfschüttler Laborzentrifuge Ultrazentrifuge Beta I; Crist, Osterode A 10, Janke & Kunke, Staufen Dist WP 3 (Hama Instruments), 1-2000 µs/cm; Roth, Karlsruhe Achat; Merck Eurolab, Darmstadt Inlab 423 (Mettler); Merck Eurolab, Darmstadt pH 91; WTW, Weilheim Turbula; Bachofen, Basel 3K-1 (max. 6000 U/min); Sigma, Osterode CG-L5-50 (max. 50000 U/min), Festwinkelrotoren 30 u. 50Ti; Beckman-Coulter, Krefeld 138 Anhang - Charakterisierung der Bindungsstellen Tab. B–2: Parameter der Küvettentests von der Dr. Lange GmbH Parameter Testkit Arbeitsbereich (ppm) TIC LCK 380 15 - 150 TOC LCK 380 60 - 735 Ammonium LCK 304 0,02 – 2,5 Nitrat LCK 339 1 – 60 Nitrit LCK 341 342 0,05 – 2 2 – 20 Sulfat LCK 353 150-1000 C Charakterisierung der Bindungsstellen Tab. C–1: Chemikalien, Materialien und sonstige Geräte – Anhang C Produkt Spezifikation, Hersteller Chemikalien Alkohole: Ethanol Methanol 2-Propanol zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt Zuckerstandards: Adonitol D(-)-Arabinose L(-)-Fucose D(-)-Fructose D(+)-Galactose D-Galacturonsäure-1-hydrat D(+)-Glucose D-Glucuronsäure α-Lactose-1-hydrat Maltose-1-hydrat D-(+)-Mannose myo-Inositol L-Rhamnose-1-hydrat D(-)-Ribose Saccharose D(+)-Xylose min. 99 %; Sigma-Aldrich, Deisendorf min. 99 %; min. 99 % min. 99,95 % min. 99 % min. 98 % min. 99,5 % 100 % 100 % min. 98 % 100 % min. 99 % min. 99 % 100 % 100 % min. 99 % Anhang - Charakterisierung der Bindungsstellen Produkt Spezifikation, Hersteller sonstige Chemikalien: 139 zur Analyse; Merck Eurolab, Darmstadt zur Analyse Uvasol (FT-IR Spektroskopie) zur Analyse zur Analyse reinst zur Analyse zur Analyse suprapur Aceton Dichlormethan Kaliumbromid Kaliumdihydrogenphosphat Natriumchlorid Natriumcitrat-2-hydrat di-Natriumhydrogenphosphat Natriumhydroxid Salzsäure Trifluoressigsäure Natriumacetat Natriumhydroxidlösung Wasser zur Synthese, min. 98 % zur Analyse; Mallinckrodt Baker, Griesheim 5 M, CO32- frei millipore; TU Berlin Messer, Berlin Gase Materialien HS-Gefäße HS-Bördelkappe Gewindeflasche 5, 10 ml; CS-Chromatographie, Langerwehe R 20-L mit PTFE-beschichtetem Butylseptum G4 (4mL) mit Schraubkappe G13 und PTFE beschichteter Dichtscheibe Einmalfilter Polyamidmembran, Porenweite 0,2 µm; M&W Chromatographietechnik, Berlin Glasperlen Merck Eurolab, Darmstadt Geräte Laborzentrifuge Reagenzglasschüttler 3K-1 (max. 6000 U/min); Sigma, Osterode VF-2; Janke & Kunke, Staufen 140 Tab. C–2: Anhang - Charakterisierung der Bindungsstellen Geräteparameter der HS-GC-FID Spezifikation GC Carlo Erba 4130 Autosampler Carlo Erba HS 250 Badtemperatur 80°C Spritzentemperatur 90°C Trägergas Helium 4.5, 4 ml/min Säule RTX-35 ; 30 m; ID. 0,25 mm; FD 3 µm Injektion 2 ml Splitinjektion (Split 10:1), 180°C Detektor FID, 260°C Brenngase Wasserstoff, 18 ml/min; Luft, 300 ml/min Make up-Gas Stickstoff 4.6, 27 ml/min Temperaturprogramm 50°C - 2 min; 10°C/min - 200°C - 5 min Datenaufnahme PC - Nelson Interface 2600 Datenauswertung Nelson Chromatography Software 5.1 Tab. C–3: Geräteparameter der HPAEC-PAD Spezifikation HPLC System HP Serie 1050 Steuerung: ChemStation - LC Rev. A 05.01 Detektor Gepulster amperiometrischer Detektor PAD II mit Goldelektrode (Dionex, Idstein) Detektoreinstellung E1 = 0,05 V, T1 = 420 ms; E2 = 0,75 V, T2 = 180 ms; E3 = -0,02 V, T3 = 360 ms; Range = 3 knA; Response time = 3s Datenaufnahme PC - Nelson Interface 2600 Datenauswertung Nelson Chromatography Software 5.1 Säule Carbopak PA1 (Dionex), 10 µm, 250 * 4 mm ID; Vorsäule Carbopak PA Guard 25 * 3 mm ID Säulenofen Jetstream 2; VDS Optilab, Montabaur Säulentemperatur 30 °C 141 Anhang - Charakterisierung der Bindungsstellen Spezifikation Injektionsvolumen 5 - 20 µL Flussrate 1 ml/min Nachsäulen pH Einstel- 0,3 N NaOH lung Mobile Phase A: 0,1 N NaOH B: H2O C: 0,1 N NaOH + 0,5 N CH3COONa 0-7 10 90 0 7,01 – 20 5 95 0 30 100 0 0 45 – 50 0 0 100 50,01 - 70 100 0 0 70,01 - 90 10 90 0 Gradient Tab. C–4: t (min) Geräteparameter der FT-IR-Spektroskopie Spezifikation Spektrometer 300E FT-IR; Jasco, Tokio Aufnahmeparameter Messbereich: 4000-600 cm-1; Akkumulation: 100; Auflösung: 4 cm-1; Gain: 2; Scangeschwindigkeit: 2 mm/s Datenaufnahme PC – Jasco FT for Windows 1.00.15 Präparationstechnik KBr Pressling Präparationsgeräte Schwingmühle; Perkin-Elmer, Überlingen Hydraulikpresse P/N 15.001 (Graseby Specac); LOT-Oriel, Darmstadt 142 Anhang - Modifizierung der Biomasse Tab. C–5: Geräteparameter der REM-Röntgenmikroanalyse Spezifikation REM Hitachi S-2700 Röntgenmikroanalyse Kevex EDS Detektor; Software IDFix 2.4 Präparationstechnik Bedampfung mit Kohlenstoff D Modifizierung der Biomasse Tab. D–1: Chemikalien, Materialien und Geräte– Anhang D Produkt Spezifikation, Hersteller Chemikalien Chloressigsäure Essigsäure Ethanol Harnstoff Natriumcarbonat Natriumhydroxid Natriumperjodat Phosphorsäure Phosphorylchlorid 2-Propanol Pyridin Titriplex III Wasserstoffperoxid Natriumchlorit Phosphorpentasulfid Wasser zur Synthese ; Merck Eurolab, Darmstadt zur Analyse zur Analyse, 85 % zur Synthese zur Analyse zur Analyse, ~80 %; Fluka, Neu-Ulm min. 98 %; Acros, Schwerte millipore; TU Berlin Materialien Bleiacetatpapier Phosphat-Test Merck Eurolab, Darmstadt 10 – 500 mg / L PO43-; Merck Eurolab, Darmstadt Geräte Laborzentrifuge 3K-1 (max. 6000 U/min); Sigma, Osterode Anhang Lebenslauf Name: Sven Klimmek Anschrift: Luxemburgplatz 2, 65185 Wiesbaden Geburtsdatum: 23.10.1971 Geburtsort: Eberswalde-Finow Familienstand: verheiratet Kinder: eine Tochter (6 Monate) 1978-1988 Polytechnische Oberschule, Eberswalde-Finow 1988-1990 Erweiterte Oberschule Eberswalde-Finow, Abschluss Abitur 1990-1991 Zivildienst Kreiskrankenhaus Eberswalde 1991-1996 Studium der Lebensmittelchemie, Technische Universität Berlin 22.12.1995 Staatsprüfung für Lebensmittelchemiker, Teil A 01-09/1996 Diplomarbeit im Institut für Lebensmittelchemie der TU Berlin 30.09.1996 Diplom-Hauptprüfung 01/1997-06/2001 Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Sonderforschungsbereich 193 Teilprojekt F2 am Institut für Lebensmittelchemie der Technischen Universität Berlin seit 08/2001 Prüfleiter bei der Institut Fresenius Chemische und Biologische Laboratorien AG