Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -1- Strategien zur HLA Typisierung mit Pyrosequencing™ vorgelegt von Diplom-Ingenieurin Patricia Entz aus Berlin Von der Fakultät III –Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Ingenieurwissenschaften - Dr.-Ing.- Promotionsauschuss: Vorsitzender: Prof. Roland Lauster Berichter: Dr. rer.nat. Marion Nagy Berichter: Prof. Ing. Ulf Stahl Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 12. Juli 2006 Berlin 2006 D 83 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -2- INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG ......................................................................................................................... 4 1.1 DAS HLA-SYSTEM ................................................................................................................. 5 1.1.1 AUFGABEN DER HLA-MOLEKÜLE IM IMMUNSYSTEM ......................................................... 8 1.1.2 DIVERSITÄT DES MHC ......................................................................................................... 9 1.1.3 DAS KOPPLUNGSUNGLEICHGEWICHT ................................................................................ 11 1.2 KRANKHEITSASSOZIATIONEN ............................................................................................ 11 1.2.1 AUTOIMMUNERKRANKUNGEN ........................................................................................... 12 1.2.2 SARKOIDOSE ....................................................................................................................... 13 1.2.3 ALOPECIA AREATA ............................................................................................................. 14 1.3 HLA TYPISIERUNGSMETHODEN ......................................................................................... 15 1.3.1 SEROLOGISCHE TYPISIERUNG ............................................................................................ 16 1.3.2 BIOCHEMISCHE VERFAHREN .............................................................................................. 16 1.3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN ............................................................................ 17 1.4 DNA-SEQUENZIERUNG MIT PYROSEQUENCINGTM ............................................................ 20 1.4.1. ENZYMATISCHE REAKTIONSKASKADE .............................................................................. 21 1.4.2 INSTRUMENTATION ............................................................................................................ 23 1.5 AUFGABENSTELLUNG .......................................................................................................... 24 2. MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................ 25 2.1 MATERIAL ............................................................................................................................ 25 2.1.1 GERÄTE .............................................................................................................................. 25 2.1.2 CHEMIKALIEN UND KITS .................................................................................................... 25 2.1.3 DNA-PROBEN..................................................................................................................... 26 2.2 METHODEN ........................................................................................................................... 27 2.2.1 HAPLOPREPTM .................................................................................................................... 27 2.2.2 PCR-REAKTIONEN ............................................................................................................. 29 2.2.3 GESAMTGENOM AMPLIFIKATION ....................................................................................... 30 2.2.4 PYROSEQUENCINGTM .......................................................................................................... 31 2.2.5 HLA-TYPISIERUNGSMETHODEN ........................................................................................ 36 2.3 STATISTISCHE BERECHNUNGEN ........................................................................................ 37 3. ERGEBNISSE ....................................................................................................................... 41 3.1 HLA-DQB1-TYPISIERUNG .................................................................................................. 41 3.1.1 HLA-DQB1-PCR-BEDINGUNGEN ..................................................................................... 43 3.1.2 PYROSEQUENCING VON HLA-DQB1 ................................................................................. 46 3.2 HLA-DRB1-TYPISIERUNG .................................................................................................. 48 3.2.1 HLA-DRB1-PCR - ALLELGRUPPENSPEZIFISCHE AMPLIFIKATIONEN ............................... 51 3.2.2 PYROSEQUENCING VON HLA-DRB1 ................................................................................. 53 3.3 HLA-B-TYPISIERUNG .......................................................................................................... 59 3.3.1 ERARBEITUNG DER TYPISIERUNGSSTRATEGIE ................................................................... 60 3.3.2 OPTIMIERTE PCR-BEDINGUNGEN FÜR HLA-B.................................................................. 63 3.3.3 PYROSEQUENCING-BEDINGUNGEN VON HLA-B ............................................................... 65 3.4 ANWENDUNGEN DER PYROSEQUENCING BASIERTEN TYPISIERUNGSSTRATEGIEN ......... 67 3.4.1 HLA-DRB1 TYPISIERUNG VON FAMILIEN-TRIOS.............................................................. 67 3.4.2 FALL-KONTROLL-STUDIE “ALOPECIA AREATA” ............................................................... 70 3.4.3 HLA-B TYPISIERUNG DER RORO-PROBEN ......................................................................... 73 3.4.4 ÜBERPRÜFUNG VON HAPLOTYPSPEZIFISCHEN EXTRAKTIONEN ........................................ 74 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -3- 4. DISKUSSION ........................................................................................................................ 75 4.1 SENSITIVITÄT DER METHODE ............................................................................................. 75 4.2 HLA-KLASSE II-TYPISIERUNG ........................................................................................... 77 4.3 HLA-KLASSE I-HLA-B ....................................................................................................... 79 4.4 VERGLEICH MIT ANDEREN HLA-TYPISIERUNGSMETHODEN ........................................... 81 5. ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................... 82 6. ANHANG............................................................................................................................... 83 6.1 LINKS ZU WEBSEITEN .......................................................................................................... 83 6.2 ABKÜRZUNGEN..................................................................................................................... 83 6.3 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................... 85 6.4 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS .............................................................................................. 89 6.4.1 ARTIKEL ............................................................................................................................. 89 6.4.2 VORTRÄGE.......................................................................................................................... 90 6.4.3 POSTER ............................................................................................................................... 90 6.5 SEQUENZÜBERSICHTEN ....................................................................................................... 90 6.5.1 HÄUFIG VORKOMMENDE HLA-DQB1 ALLELE .................................................................. 91 6.5.2 HÄUFIG VORKOMMENDE HLA-DRB1-ALLELE ................................................................. 95 6.5.3 HÄUFIG VORKOMMENDE HLA-B ALLELE ....................................................................... 101 DANKSAGUNG .......................................................................................................................... 119 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG............................................................................................. 120 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -4- 1. Einleitung Der Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) ist ein evolutionär sehr alter, zusammenhängender Abschnitt im Genom der Säugetiere. Er besteht aus einer Reihe gekoppelter Genloci. Die dort kodierten Proteine, die Leukozytenantigene sind an wichtigen Funktionen des Immunsystems beteiligt – der Unterscheidung von körpereigenen von körperfremden Proteinen und dem Auslösen einer Immunantwort. Den MHC des Menschen bezeichnet man auch als HLA (human leucocyte antigene)-System. Diese Zelloberflächenproteine spielen eine wichtige Rolle bei der T-Zell Erkennung. Bei der Transplantation sind sie für eine eventuelle Abstoßungsreaktion verantwortlich. Die Gene des MHC sind darüber hinaus mit einer Vielzahl von Erkrankungen assoziiert, mehr als jede andere Region im humanen Genom. Spezifische Allele sind assoziiert mit Krankheiten wie zum Beispiel Typ I Diabetes, Narkolepsie, Psoriasis und rheumatische Arthritis. In vielen anderen Fällen dienen HLA Moleküle aber auch als Marker, die bestimmte Risikohaplotypen kennzeichnen können. Viele der HLA Gene sind hochpolymorph, wodurch sie auch für die forensische Anwendung, z.B. in komplizierten Abstammungsbegutachtungen interessant sind. Daher ist die effiziente und verlässliche HLA-Typisierung ein wichtiges Werkzeug in der Diagnostik und Forschung. Abb. 1.1 – Schematische Übersicht über die HLA-Region auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -5- Pyrosequencing™ ist eine relativ neue Methode zur DNA-Sequenzierung. Der Vorteil des Pyrosequencings gegenüber der konventionellen DNA-Sequnzierung nach dem Kettenabbruch-Prinzip liegt in ihrer Schnelligkeit, vor allem bei der Analyse kurzer Sequenzabschnitte. Auch die Auflösung heterozygoter Positionen ist häufig besser gewährleistet. Die Methode eignet sich zur Automatisierung und zum Einsatz in der Hochdurchsatz-orientierten Genotypisierung. In der Arbeit wurden Strategien entwickelt, wie die Anwendung der PyrosequencingTechnologie als neue Alternative bzw. Ergänzung zu bestehenden HLA- Typisierungsmethoden genutzt werden kann. 1.1 Das HLA-System Versuche der Menschen Gewebe, Haut oder Organe zu verpflanzen wurden schon vor langer Zeit vorgenommen. So wird beispielsweise berichtet, dass im 3. Jahrhundert die katholischen Schutzpatrone der Pharmazie, St. Cosmos und St. Damian ein Bein eines verstorbenen schwarzen Mannes auf einen weißen Mann verpflanzt hätten. Im 17.Jahrhundert gab es Versuche, zerstörte menschliche Haut durch tierisches Gewebe zu ersetzen. Im 19. Jahrhundert fanden dokumentierte Versuche von Hauttransplantationen statt. 1902 versuchte sich der Chirurg Emerich Ullmann in Wien an einer Nierentransplantation im Tierversuch. Er transplantierte eine Niere in den Nackenbereich eines Hundes und führte den Harnleiter über der Haut entlang, um die Harnproduktion dokumentieren zu können. Die Niere soll so 5 Tage lang gearbeitet haben. Nach mehreren wenig erfolgreichen Versuchen von Nierentransplantationen vom Tier auf den Menschen bzw. zwischen Menschen in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, gelang die erste erfolgreiche Organverpflanzung am Menschen 1954 in Boston durch Dr. Joseph Murray. Die Nierentransplantation erfolgte zwischen eineiigen Zwillingen, also zwischen Menschen mit identischen Gewebemerkmalen. Dausset beschrieb 1958 das erste Leukozyten Antigen “MAC”, später benannt mit HLA-A2. Dies wird in der Literatur oft als die „Entdeckung des HLA-Systems“ bezeichnet. Diese Forschungserfolge erbrachten nun auch eine wissenschaftliche Erklärung, warum die meisten Transplantationsversuche bis dato tragisch enden mussten. 1980 erhielten Benaerraf, Dausset und Snell den Nobelpreis für Medizin für ihre Forschungen zu genetisch determinierten Strukturen auf der Zelloberfläche, die die immunologischen Reaktionen regulieren. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -6- Im Jahre 1964 fand der erste Workshop der International Histocompatibility Working Group (IHWG) statt, bei dem unter anderem das erste gemeinsame Gewebegruppensystem erstellt wurde, das die verschiedenen Modelle zur Beschreibung der Antikörper wie „Hu-1“ (Dausset, Ivanyi), „LA“(Payne, Bodmer) und „Four“(van Rood) zusammenbrachte und welches später den Namen „HLA“ bekam (Quelle: http://www.ihwg.org/history/history.htm). In diesem Rahmen wurden die Erkenntnisse rund um den MHC bzw. das HLA-System von Wissenschaftlern aus aller Welt zusammengetragen. Bis heute wird dieser Wissensstand um HLA-Genorte, -Allele und Typisierungstechniken ständig erweitert. Eine vereinheitlichte Nomenklatur wird durch das Nomenclature Commitee IHWG festgelegt und neue Allele danach benannt. Die Allele der HLA-Loci werden in einer Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc/MHC.cgi?cmd=init) (Zugriff z.B. zusammengetragen über und regelmäßig auf den neuesten Stand gebracht. Mit Hilfe der spezifischen HLA-Merkmale unterscheidet das Immunsystem zwischen fremdem Gewebe und eigenem. Fremdes wird vom Immunsystem abgestoßen, eine gesunde Fähigkeit des Körpers, sich gegen Angreifer von außen zur Wehr zusetzen. Negative Auswirkungen können aber im Falle von Transplantationen oder aber bei Autoimmunerkrankungen eintreten, wenn diese Fähigkeit sich gegen den eigenen Körper, bzw. gegen transplantiertes Gewebe richtet. Die MHC-Region des Menschen ist ca. 3800 kb lang. Die HLA-Genorte befinden sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 in der zentromer nahen Region 6p21. Die Gene werden in drei funktionelle Klassen, welche auch den jeweiligen Subregionen entsprechen, eingeteilt: - Klasse I mit den Loci HLA-A, -B und -C, die klassischen „Transplantationsantigene“. Der Organismus des Empfängers erkennt von ihm abweichende HLA-Antigenstrukturen des Spender-Organs. Diese Klasse-IProteine sind auf jeder Zelle eines Säugetieres vorhanden. Innerhalb des Immunsystems ist ihre Anwesenheit auf der Oberfläche von Killer-T-Zellen für die zelluläre Immunität erforderlich. Die Klasse I Subregion enthält auch die Gene, welche für die nicht-klassischen Klasse I Moleküle HLA-E, -F und -G kodieren. HLA-E und –F werden ebenfalls in den meisten Geweben exprimiert. HLA-G dagegen wurde bisher nur auf Cytothrophoblasten der Plazenta, mononuklearen Phagozyten und embryonalen Zellen gefunden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - -7- Klasse II, auch als HLA-D bezeichnet, mit den Loci DR, DQ, DZ/DO und DP. Die entsprechenden Proteine findet man auf der Zelloberfläche von B-Zellen, in aktivierten T-Zellen, dendritischen Zellen sowie auf Makrophagen. Diese Proteine wirken an der für die Immunantwort notwendigen Zellkommunikation mit und sind insbesondere für die Funktion der Helfer-T-Zellen erforderlich. In der Klasse II Subregion sind noch weitere Gene kodiert, die in der Prozessierung und beim Transport von Antigenen eine Rolle spielen, wie LMP2, LMP7, TAP1 und TAP2. Außerdem befindet sich in diesem Abschnitt auch das Gen für das HLA-DM Heterodimer, welches an der Beladung von Peptiden auf HLA Klasse II Moleküle beteiligt ist. - Klasse III, kodieren die so genannten Komplementproteine. Ihre Loci werden auch als S-Region bezeichnet. Sie sind beteiligt an der Lyse von Fremdzellen bei der humoralen Immunantwort durch Wechselwirkungen mit AntigenAntikörperkomplexen. Die Klasse III Subregion befindet sich zwischen den anderen beiden Abschnitten und beinhaltet die Gene für diverse Proteine wie den Tumornekrose Faktor (TNF) und Hitzeschock Proteine (HSP). 5‘ SP a1 270 bp Ex1 Ex2 a2 276 bp Ex3 a3 TM CP CP Ex5 Ex6 Ex7 CP 3‘ 276 bp Ex4 Ex8 Abb. 1.2 - Struktur der HLA Klasse I Gene. SP: Signalpeptid, TM: Transmembrandomäne, CP: Cytoplasmatischer Teil. Die Polymorphismen sind überwiegend in den Exonen 2 und 3 lokalisiert, Exon 1 und die Exone 4-8 bestehen überwiegend aus konservierten Sequenzen. Die Gene für die Klasse I verteilen sich über eine Region von mehr als 1700 kb. Daran schließt sich ein etwa 550 kb langer Bereich an, in dem sich die Klasse III Gene, wie z.B. die für TNFα und TNFβ befinden. Auf die Komplementgene folgen dann die der Klasse II (etwa 100 kb), in der Reihenfolge DR, DQ und DP (Abb.1.1). Alle MHC-Proteine sind Dimere, sie sind in die Plasmamembran eingelagert und ragen in den extrazellulären Raum. MHC Klasse I und II-Antigene haben eine ähnliche Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -8- Struktur, aber bestehen aus anderen Komponenten. Die Klasse I Antigene bestehen aus einem Dimer der Klasse I Kette und einem Β2-Microglobulin. Sie besitzen drei extrazelluläre Domänen. Im Exon 1 wird die Signalsequenz kodiert, welche für den Transport durch die Membran benötigt wird und im Anschluss daran abgespalten wird. Die Exone 2, 3 und 4 kodieren jeweils eine der drei extrazellulären Domänen, wobei das Exon 4 im Gegensatz zu den anderen beiden recht stark konserviert ist. Diese Domäne ist mit dem β2-Microglobulin in Interaktion. Die Transmembrandomäne wird vom Exon 5 kodiert, in Exon 6 und 7 befindet sich der Code für den cytoplasmatischen Teil des Proteins (Abb. 1.2). Klasse II Proteine bestehen aus zwei Ketten, α und β und bilden zwei extrazelluläre Domänen aus. Die Verteilung der Regionen ist ähnlich wie bei der Klasse I (Abb.1.3). Das Exon 1 enthält die 5’ nicht-translatierte Region und die Leadersequenz für den Membrantransport. Exon 2 und 3 bilden die externe Domäne, wobei das Exon 2 den größten Teil der polymorphen Positionen beinhaltet. Das Exon 4 enthält die Transmembranregion und manchmal auch schon Teile der cytoplasmatischen Region, welche sonst noch von den Exonen 5 und 6 kodiert wird und schließlich auch noch der 3’ nicht-translatierte Teil. 5‘ SP b1 b2 TM CP 270 bp Ex1 282 bp 111 bp Ex2 Ex3 Ex4 Ex5 3‘ 24 Ex6 Abb. 1.3 - Struktur der HLA Klasse II Gene, hier der b-Kette. SP: Signalpeptid, TM: Transmembrandomäne, CP: Cytoplasmatischer Teil. Die Polymorphismen sind überwiegend im Exon 2 lokalisiert. Die anderen Exone bestehen überwiegend aus konservierten Sequenzen. 1.1.1 Aufgaben der HLA-Moleküle im Immunsystem Bei der Immunabwehr von Pathogenen werden Fremdproteine in Peptide zerlegt und in den Peptidbindungsgruben der HLA-Moleküle gebunden. In diesen Furchen liegen die polymorphen Bereiche der MHC-Moleküle und bilden dort spezifische „Taschen“. Die konservierten Bereiche bilden einerseits das Gerüst, bilden aber auch Anheftungspunkte für verbreitete Peptidmotive. Die Peptide in den Bindungsfurchen der Klasse II Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung -9- Moleküle sind insgesamt länger und heterogener, als die der Klasse I Moleküle. Jedes MHC-Molekül kann so eine große und charakteristische Auswahl an Proteinen binden. Die HLA-Moleküle transportieren diese Peptide an die Zelloberfläche und präsentieren sie dort den T-Zellen. Es gibt zwei Klassen von T-Zellen, die sog. Helfer-T-Zellen, welche die Aktivität anderer an der Immunantwort beteiligter Zellen verstärken und die cytotoxischen T-Zellen, welche infizierte Zellen vernichten. Beide T-Zelltypen sind in der Lage die Peptide zu erkennen, die durch die Zerlegung der vollständigen Antigene innerhalb der Zelle entstanden sind. HLA-Klasse I Moleküle binden endogene Antigene (z.B. virale) und präsentieren sie den (CD8+) cytotoxischen T-Zellen. Die Klasse II Moleküle erfassen exogene Antigene (z.B. bakterielle Toxine) und präsentieren sie den (CD4+) Helfer-T-Zellen. 1.1.2 Diversität des MHC Die MHC Loci sind in Menschen, Mäusen und vielen anderen Säugetieren hochgradig polymorph, die Heterozygotierate liegt normalerweise bei 80-90%. Die Diversität der Antigen-präsentierenden Abschnitte hat sich über zwei Mechanismen entwickelt, einmal durch eine Ansammlung von Punktmutationen über einen sehr langen Zeitraum (evolutionär sehr alter Genomabschnitt) und andererseits durch Genkonversion und Rekombinationen. Die Punktmutationen finden nur sehr selten statt und sind daher nicht von so großer Wichtigkeit für die hohe Zahl der Allele. Genkonversionen, Rekombination und Selektionsmechanismen scheinen die entscheidenden Faktoren für die hohe Diversifizierung der HLA-Genorte zu sein. Schaut man sich eine Sequenzübersicht eines HLA-Locus an, sieht man oft, dass die unterschiedlichen Allele aus verschiedenen Kombinationen der gleichen Motive bestehen. Diese Struktur scheint durch rekombinierte Segmente entstanden zu sein. Ein weiterer Punkt, der die Entstehung und vor allem Erhaltung der hohen Alleldiversität begründet, sind mögliche Selektionsvorteile, heterozygote von seltenen Individuen sind und heterozygoten homozygoten MHC-Genotypen. Individuen im Kampf HLA gegen Krankheitserreger überlegen, weil sie ein größeres Spektrum an Möglichkeiten zu Bindung von Antigenen besitzen. Beispiele für den hohen Selektionsdruck auf den MHC, durch spezielle Infektionskrankheiten sind z.B. „Mareks Disease“ in Hühnern (Briles, 1983) und Malaria in Menschen (Hill et al., 1991). Weiterhin haben sich heterozygote Genotypen Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 10 - in der Abwehr bestimmter Antigene als erfolgreicher erwiesen, als homozygote, so sind z. B. bestimmte heterozygote Genotypen bei HIV Infektion (Carrington, 1999) und bei Hepatitis B vorteilhaft für den Krankheitsverlauf (Thursz, 1997). Ein anderer Faktor, der zur Erhaltung der hohen Diversität des MHC bzw. HLA beiträgt, könnte in der MHC-basierten Auswahl des Partners liegen. Verschiedene Studien beschäftigten sich mit dem Zusammenhang zwischen HLA-Genotypen, Körpergeruch und Partnerwahl, bzw. der Erkennung von Verwandten und eigenen Kindern. Die Grundlage für den Mechanismus soll darin liegen, dass Vertebraten den MHC Genotyp ihres Gegenübers am Geruch erkennen können (Boyse, 1983; Brown, 1987; Singh,1987) und so z.B. ihre Kinder und Verwandten „erriechen“ (Manning, 1992; Yamazaki, 1979, Brown, 1994). Männliche, freilebende Rhesus Affen (Macaca mulatta) mit heterozygotem Mamu-DQB1 Typ zeugen signifikant mehr Nachkommen, als ihre Artgenossen mit homozygotem MHC Klasse II Genotyp (Sauermann, 2001). Der Vorteil scheint dabei unabhängig vom tatsächlich vorliegenden Genotyp zu sein. Bei den Weibchen hatte ein homo- oder heterozygoter Genotyp keine Auswirkung auf die Anzahl der Nachkommen. Der Vorteil von Nachkommen MHC-verschiedener Eltern liegt im oben erläuterten, erhöhten Schutz vor Infektionskrankheiten durch MHC Heterozygosität. Ein weiter Hintergrund der hohen Polymorphie der MHC Gene findet sich in der Überlebensrate von Föten, welche höher ist, wenn sie sich im MHC-Genotyp von der Mutter unterscheiden. Eine Studie mit ungewollt kinderlosen Paaren ergab eine signifikant niedrigere Erfolgsrate für in vitro Fertilisationen, wenn die Paare einen gemeinsamen HLA Genotyp besaßen (Ho, 1994). Im Tiermodell fanden sich ebenfalls Hinweise auf höhere Abort Raten bei Ratten mit homozygotem MHC Genotyp (Palm, 1974). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 11 - 1.1.3 Das Kopplungsungleichgewicht Eine bemerkenswerte Eigenschaft des MHCs besteht darin, dass einige Kombinationen von HLA-A, -B und –DR Allelen häufiger auftreten, als man es ausgehend von ihren Allelfrequenzen erwarten müsste. Dieser Umstand wird vor allem durch Selektionsmechanismen (Begovich, 1992, Thomsen, 1994) hervorgerufen. Dieses Phänomen, das allgemein auch als Kopplungsungleichgewicht (engl. Linkage Disequilibrium, LD) bezeichnet wird, ist Quelle vieler Spekulationen. Eine Hypothese besagt, dass bestimmte Haplotypen nicht rekombinieren. Eine andere Theorie ist, dass diese HLA Antigene bevorzugt rekombinieren nach einem cross-over um einen LD Haplotyp zu erzeugen. Diese Hypothesen wurden von Termijtelen und seiner Gruppe überprüft (Termijtelen, 1995). Ihre Resultate zeigen, dass die Anzahl der cross-over durch LD Haplotypen nicht signifikant niedriger ist, als wenn die Rekombination zufällig erfolgt. Auch die Anzahl der durch Rekombination erzeugten LD-Haplotypen war nicht signifikant erhöht. Das Kopplungsungleichgewicht kann demzufolge nicht durch selektive Rekombination erklärt werden. Die Rekombinationsraten liegen im Bereich von <0,2% zwischen HLA-DRB1 und HLA-DQB1 bis 1,3% zwischen HLADRB1 und HLA-B. 1.2 Krankheitsassoziationen HLA-Gene werden mit unterschiedlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Auf Grund der Funktion der HLA-Moleküle ist es nicht verwunderlich, dass bestimmte HLA-Typen ihre Träger für spezielle Krankheiten anfälliger machen oder gegen spezifische Erkrankungen besonders effizient schützen. Man geht von einer Assoziation aus, wenn die Allelfrequenzen von krankheitsbegünstigenden Antigenen bei Krankheitsbetroffenen erhöht sind (bzw. protektive Antigene erniedrigt). Bestimmte HLA-Allele sind assoziiert mit Krankheiten wie Typ I Diabetes, Narkolepsie, Psoriasis, Zöliakie und rheumatoider Arthritis. Die Bestimmung der HLAAllele stellt z. T. ein diagnostisches Kriterium für diese Krankheiten dar. In vielen anderen Fällen dienen HLA-Allele aber auch als Marker, die bestimmte Risikohaplotypen kennzeichnen können. In der Tabelle 1.1 ist eine Auswahl an HLAassoziierten Krankheiten zusammen gestellt. Eine der am intensivsten untersuchten HLA-assoziierten Erkrankungen ist Typ I Diabetes (Diabetes mellitus). Andere Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 12 - spezifische HLA-Allele haben eine protektive Funktion bei viralen Erkrankungen, wie z.B. HIV. Die Rolle des MHC in der immunologisch bedingten Anfälligkeit für Viruserkrankungen wurde erstmals beschrieben von Zinkernagel und Doherty (1974). Sie beschrieben, dass das Virus spezifische zytotoxische T-Zellen, sowohl virale Antigene, als auch MHC-Moleküle erkennt. HLA Klasse I Restriktion mit zytotoxischen T-Zell Lymphozyten spielt eine Hauptrolle in der Immunantwort und der Zerstörung von virusinfizierten Zellen. Verschiedenen Studien belegen auch die HLA Assoziation von HIV. Die Auswirkungen sind unterschiedlich. Es werden unterschiedliche Geschwindigkeiten der Krankheitsprogression bei speziellen B-Allelen beschrieben. Als potentiell protektiv gelten die Allele HLA-B27, -B35 und -B57. Für andere Allele wird eine besonders schnelle Progression der Krankheit beschrieben. In der Literatur findet man Bw4 (eine Teilstruktur von HLA-B-Antigenen) Homozygosität assoziiert mit Protektion. In unterschiedlichen Arbeiten und Studien, die verschiedene Populationen betreffen, finden sich unterschiedliche Assoziationen. So wird einerseits B35 (Bw6) als protektiv beschrieben, andererseits als beschleunigend. 1.2.1 Autoimmunerkrankungen Unter den HLA-assoziierten Erkrankungen befinden sich viele so genannte Autoimmunerkrankungen, die darauf beruhen, dass das Immunsystem körpereigene Strukturen als „fremd“ betrachtet und angreift. Ein Beispiel dafür ist die rheumatische Erkrankung Morbus Bechterew, die u.a. zu einer Versteifung der Wirbelsäule führt. Menschen mit einem HLA-B27 Allel haben ein stark erhöhtes Risiko, an Morbus Bechterew zu erkranken. Gefährdet ist allerdings nicht jeder HLA-B27-Träger. So ist mit dem Allel B*2709 keine erhöhte Gefahr verbunden zu erkranken, wohl aber mit dem Allel B*2705. Der Unterschied zwischen den beiden Allelvarianten besteht in nur einer einzigen Aminosäure im HLA-Molekül, die genau in der Bindungsfurche liegt. Dadurch kann ein körpereigenes Peptid in besonderer Form an das HLA-Molekül gebunden werden. Bei Menschen mit der Variante B*2709 (His116) geschieht dies in konventioneller Weise und die T-Zellen reagieren darauf nicht. Der Mensch bleibt gesund. Bei Trägern der B*2705-Variante (Asp116) sorgt die spezielle Aminosäure dafür, dass hier das gleiche körpereigene Peptid in anderer Weise gebunden wird und damit in einer Konformation vorliegt, die von T-Zellen als fremd eingestuft und attackiert wird. Die Autoaggression hängt hier also von einer einzigen Aminosäure ab (Hülsmeyer et al., 2004). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 13 - Tabelle 1.1 - Eine Auswahl von HLA-Klasse I assoziierten Erkrankungen. HLA-assoziierte HLA-Antigen Relatives Risiko* Morbus Bechterew B27 69-87 Morbus Reiter B27 38 Akute vord. Uveitis B27 11 rheumatoide Arthritis B27 5 Psoriasis vulgaris Cw6 8-33 Morbus Behcet B5 6 Myasthenia gravis B8, DR3 4 subakute Thyreoiditis Bw35 14 Idiop. Hämochromatose A3 8 Diabetis melitus DR3, DR 4 25 Pemphigus vulgaris DR4 14 Multiple Sklerose DR2, DQ6 2,7-5 Narkolepsie DR15/DQ6 130 Goodpasture-Syndrom DR2 13-16 Erkrankungen * Das Relative Risiko gibt an, um welchen Faktor die Krankheit bei einem Merkmalsträger häufiger auftritt als bei einem Nicht-Merkmalsträger Quellen: J.L. Tiwari, P.I. Terasaki, 1985; E. Thorsby, 1997 1.2.2 Sarkoidose Sarkoidose ist eine entzündliche Erkrankung, die in etwa 90% der Fälle die Lungen befällt. Es können aber praktisch auch alle anderen Organe betroffen sein, häufig sind auch Auswirkungen auf Haut, Augen oder Lymphknoten. Die Ursache der Erkrankung ist unbekannt. Es stehen Autoimmunmechanismen, aber auch chemische Substanzen oder Mikroorganismen im Verdacht an der Auslösung der Krankheit beteiligt zu sein (Luisetti, 2000). Verschiedene Studien (Rossman, 2003) legen nahe, dass HLA-Allele, insbesondere HLA-DRB1 Allele mit der Erkrankung assoziiert sind. Ein SNP Feinmapping der Region 6p21 ergab einen signifikanten Hinweis auf eine „Splicesite“Veränderung von BTNL2 durch den SNP rs2076530 (Valentonyte et al., 2005). Der Genort BTNL2 liegt in der Subregion der HLA-Klasse II-Gene in Nachbarschaft (~ 200 kb) zu HLA-DRB1. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 14 - 1.2.3 Alopecia areata Alopecia areata ist eine Erkrankung des Immunsystems ungeklärten Ursprungs, die sich in einer Immunreaktion gegen die eigenen Haarfollikel äußert. Sie ist die häufigste entzündliche Haarausfallerkrankung, von der ca. 1,4 Millionen Menschen in Deutschland betroffen sind. Die betroffenen Patienten leiden unter Haarausfall in unterschiedlicher Stärke. Typischerweise äußert sich die Erkrankung in kreisrunden, kahlen Stellen am Kopf. Dieser Phänotyp der Erkrankung wird als „patchy“ Alopecia bezeichnet. Der Haarausfall kann aber weiter fortschreiten und dann zum Verlust aller Kopfhaare (alopecia totalis, AT) oder sogar zum Verlust der kompletten Körperbehaarung (alopecia universalis, AU) führen. Zei Beispiele sind in Abb. 1.4 gezeigt. Die Ethiopathogenese der Krankheit ist bisher noch nicht geklärt, verschiedene Studien belegen aber einen Zusammenhang zwischen Alopecia und HLA. Dabei zeigt sich, dass die assoziierten Allele zwischen unterschiedlichen Populationen differieren, wie auch die Allelfrequenzen für die unterschiedlichen Bevölkerungen sehr verschieden sein können. Für verschiedene Populationen sollte deshalb nach speziellen assoziierten Allelen gesucht werden. Abb.1.4 - Beispiele für die Erscheinungsformen von Alopecia areata. Das erste Foto zeigt einen Patienten mit “patchy” Alopecia, das zweite Bild zeigt einen von Alopecia totalis betroffenen Patienten. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 15 - 1.3 HLA Typisierungsmethoden Auf Grund der Bedeutung der HLA Typisierung für die Anwendung in der medizinischen Praxis und in der Forschung, wurden verschiedene Möglichkeiten zur Typisierung mit unterschiedlich hohen Auflösungsgraden entwickelt. Grundsätzlich gibt es Möglichkeiten zur HLA-Typisierung auf serologischer und genetischer Ebene. Zur Auswahl einer geeigneten Typisierungsstrategie sollte die spezielle Anwendung und die erforderliche Auflösung berücksichtigt werden. Unter einer niedrigen Auflösung versteht man hier ein Untersuchungsergebnis, welches zu einer zweistelligen Benennung des Allels (2-digit resolution) führt, was der Allelgruppe entspricht und welche durch die serologische Testung praktisch erreicht wird. Eine hoch auflösende Typisierung, mit einer vierstelligen Allel- Bennennung (4-digit resolution) bezeichnet dann das Allel genauer – alle DNA-Sequenzen, mit gleicher 4-stelliger AllelBezeichnung werden in die gleiche AS-Sequenz übersetzt. Die trotzdem möglicherweise unterschiedliche DNA Sequenz, kann durch stumme Basenaustausche zustande kommen und wird in der 6-stelligen Allel-Benennung berücksichtigt (vergl. Abb. 1.5). Das lässt sich noch ausweiten auf eine achtstellige Bezeichnung, die dann noch intronische Polymorphismen mit berücksichtigt, wobei die praktische Bedeutung gering ist. Eine zusätzliche Bezeichnung ist noch „N“ für Nullallele (nicht exprimierte Allele). Weitere Kriterien zur Methodenauswahl sind Zeit- und Personalbedarf, Automatisierungsmöglichkeiten und die Kosten einer Methode. Genort Gruppe, niedrige Auflösung HLA- DRB1 * 03 molekular genetisch stille Mutation, codierende Nukleotidsequenz 01 01 Allel, entspricht ASSequenz 01 Mutation im Intronbereich Abb. 1.5 - Nomenklaturschema zur Benennung von HLA-Allelen Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 16 - 1.3.1 Serologische Typisierung Die klassische serologische HLA Typisierung, der so genannte Mikrolymphozytotoxizitätstest (LCT) (Terasaki, McClelland, 1964), wird nach wie vor in vielen Laboratorien eingesetzt. Dazu werden vitale Lymphozyten mit zytotoxischen Antikörpern und Komplement (Kaninchenserum) inkubiert. Befindet sich das korrespondierende HLA-Antigen auf der Zelloberfläche, werden die Lymphozyten lysiert und nehmen Farbstoff auf. Nicht lysierte Zellen bleiben ungefärbt. Die Auswertung erfolgt mikroskopisch. Vor allem zur HLA-A und HLA-B-Typisierung von Patienten vor Nieren-Transplantationen und Knochenmarkspendern ist der Test eine schnelle und günstige Methode zur Typisierung bzw. Vortypisierung. Dabei können 63 Hauptantigene, über spezifische Antikörper nachgewiesen werden, nach denen bereits eine Vorauswahl eines geeigneten Spenders erfolgen kann. Zur Bestimmung eines HLA-A, -B-Typs kommen kommerzielle Serensets mit 72 bis 120 verschiedenen Antiseren zum Einsatz. Diese Methode ist die einzige gebräuchliche, bei der die tatsächlichen Interaktionen zwischen Zellen und Antikörpern beobachtet werden. Daher wird sie auch weiterhin für die Verträglichkeitstestung im Zusammenhang mit Transplantationen und Transfusionen im Einsatz bleiben. Die Nachteile der serologischen Typisierung liegen darin, dass nur eine grobe, grundsätzliche Einteilung in die HLA-Hauptgruppen erfolgen kann. Dazu sind viele Seren nötig und es kommt dazu, dass der Typisierungserfolg deutlich von der Vitalität der Zellen abhängt, was bedeutet, dass durch die Instabilität der Lymphozyten frisches Blut in ausreichender Menge zur Verfügung stehen muss. Damit ist die Methodik z.B. für die Anwendung in größeren und längerfristigen Studien ungeeignet. 1.3.2 Biochemische Verfahren Eine Möglichkeit zur Charakterisierung von HLA-Molekülen ist die isoelektrische Fokussierung (IEF). Durch die unterschiedlichen isoelektrischen Punkte können HLAKlasse I Moleküle detektiert werden. Durch Western Blots in Verbindung mit polybzw. monoklonaren Antikörpern können gezielt bestimmte HLA-Moleküle dargestellt werden. Diese Verfahren werden für Expressionsnachweise von HLA-Molekülen, z.B. auf Tumorzellen eingesetzt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 17 - 1.3.3 Molekularbiologische Verfahren Die DNA basierten Typisierungsverfahren wurden zunächst für die Klasse II Genorte entwickelt und dann auf die Klasse I Genorte ausgedehnt. Sie haben gegen über der serologischen Untersuchung den Vorteil, dass das nötige Material, die DNA der zu untersuchenden Personen, auch langfristig gut lagerfähig ist. Für große Studien besteht die Möglichkeit der Einrichtung von Zelllinien zur Gewinnung von weiterer DNA. Die Typisierung auf diesem Wege ist sehr viel sicherer und höher auflösend. Gängige DNA basierte Typisierungsmethoden sind die sequenz-spezifische Oligohybridisierung (SSO), die Sequenzierung (SBT) und das sequenz-spezifische Priming (SSP). SSO und SSP sind aussagekräftige Methoden, wenn es darum geht bekannte Sequenzmotive zu detektieren. Es sind allerdings eine große Menge immer wieder zu aktualisierende Sonden und Primern nötig, um mit der wachsenden Zahl an Allelen Schritt zu halten. Die SSO-Methoden beinhalten generische oder gruppenspezifische PCRs zur Amplifikation des zu untersuchenden Abschnitts mit anschließender Hybridisierung der spezifischen Sonden. Die Sonden sind normalerweise in Streifenform auf Membranen immobilisiert. Es gibt inzwischen aber auch Entwicklungen mit Sonden auf Chips oder Mikrosphären. Die Auflösung der SSO-Analysen ist mittelmäßig, erfordert relativ wenig DNA und ist gut zu automatisieren (z.B. Auto-LIPA, Innogenetics). Beadbasierte Methoden, wie z.B. „LUMINEX“ oder „TEPNEL“ erlauben eine SSO auf der Oberfläche von Mikrosphären. Durch zwei unterschiedliche Untersuchungen der Emissionen können verschiedene Typisierungsschritte in einem Durchgang erfolgen. Die mit unterschiedlichen Nukleotidsonden beladenen Mikrosphären sind durch verschiedene Farben unterscheidbar. Diese Methoden sind noch recht neu und erfordern spezielle Geräte. Der Durchsatz lässt sich mit diesen automatisierten Verfahren jedoch gut steigern. Die PCR-SSP Methode besteht aus einer Reihe von PCR-Reaktionen mit sequenzspezifischen Primern. Je nach Anzahl der verwendeten Primer ist die Auflösung von gering über mittel-hoch bis zu hoch steigerbar. Die Analyse kann relativ schnell und einfach erfolgen. Der DNA-Verbrauch ist allerdings sehr hoch und die verwendete DNA muss von guter Qualität sein. Auch durch Kombination von SSO mit SSP Methode lassen sich hoch auflösende Typisierungsergebnisse erzielen. Der Vorteil der Typisierungsstrategien die auf DNA-Sequenzierung basieren, ist die Möglichkeit neue Sequenzmotive zu entdecken. Das SBT erfordert ebenfalls gute DNA Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 18 - Qualität und einen recht hohen Aufwand. Die Auflösung ist hoch, jedoch muss auch hier mit nicht auflösbaren Ambiguitäten gerechnet werden. Probleme können durch Sequnzierartefakte und bei der Zuordnung heterozygoter Positionen auftreten. Zur eindeutigen Lösung vieler Allelkombinationen sind z.B. Verknüpfungen von SSP Methoden mit dem SBT nötig, so dass eine allelspezifische Sequenzierung möglich wird. Wie schon im Abschnitt über die Diversität des HLA-Systems erwähnt, bestehen die Allele häufig aus verschiedenen Kombinationen der gleichen Sequenzmotive. Das muss bei der Typisierungsstrategie in so fern berücksichtigt werden, da nicht nur das Vorhanden sein oder die Abwesenheit eines Sequenzmotivs entscheidend sind, sondern auch die Anordnung der Motive zueinander (gleicher Strang, anderer Strang, cis/trans). Zur eindeutigen Klärung reichen die generischen Typisierungsansätze oft nicht aus. Dann werden allel- oder allelgruppenspzifische Amplifikationsverfahren benötigt, um die Allele getrennt von einander untersuchen zu können. Eine recht neue Technik zur Alleltrennung ist die haplotyp-spezifische Extraktion (HSE), an die sich dann wiederum die unterschiedlichen Typisierungsverfahren anschließen können. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 19 - Tabelle 1.2 - Übersicht über die gängigen HLA-Typisierungsmethoden HLA-Typing Methoden Art Auflösung Anwendung Lymphozytotoxizitäts- Test serologisch niedrig Klasse I Antigene HLA-A, -B (LCT) und –C Klasse II Antigene, HLA-DR und -DQ Spendersuche innerhalb der Familie, Spenderregistrierung KMT, Verträglichkeitstestung (Kreuztest) Isoelektrische Fokussierung biochemisch niedrig Expressionsnachweise Sequenz-spezifische molekular- niedrig bis Klasse I und II Genorte Oligohybridisierung (SSO) genetisch mittel (IEF) Spender-/Empfänger Auswahl vor Nierentransplantation; Spenderauswahl vor Knochenmarkstransplantation Sequenz-Spezifisches Priming molekular- niedrig bis Klasse I und II Genorte (SSP) genetisch hoch Spender-/Empfänger Auswahl vor Nierentransplantation; Spenderauswahl vor Knochenmarkstransplantation, Assoziationsstudien Sequenzierungs–basierte molekular- Typisierung (SBT) hoch genetisch Klasse I und II Genorte Spenderauswahl vor Knochenmarkstransplantation, Assoziationsstudien Mikrosateliten (MS) molekular- /Einzelnukleotidpolymorphism genetisch en (SNP) niedrig Assoziationsstudien Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 20 - 1.4 DNA-Sequenzierung mit PyrosequencingTM Die „klassische“ DNA-Sequenzierung nach dem Didesoxykettenabbruchsystem, 1977 von Sanger entwickelt, wurde seit dem ständig weiterentwickelt. Große, oft per Hand gegossene Elektrophoresegele wichen den handlichen Kapillaren, radioaktive Markierungen wurden von chemischen abgelöst und die umständliche Detektion mit Filmen wurde durch die moderne Lasertechnologie ersetzt. Trotz der Verbesserungen ist die Sequenzierung eines DNA-Abschnittes noch immer mit verhältnismäßig großem Aufwand verbunden. In den letzten Jahrzehnten wurden alternative Methoden zur Analyse, insbesondere für kurze Sequenzabschnitte entwickelt. Einer dieser Ansätze ist das Pyrosequencing™ (Ronaghi et al., 1996; 1998; 2001). Die Methode wurde 1996 von Mitarbeitern des „Royal Institute of Technology“ in Stockholm entwickelt. Die 1997 in Uppsala gegründete Firma „Pyrosequencing AB“ entwickelte die Methode weiter und vermarktet sie kommerziell. Diese DNA-Sequenzierungstechnik basiert auf der Detektion des während des Strangaufbaus freigesetzten Pyrophosphats. Durch eine Kaskade enzymatischer Reaktionen wird Licht generiert. Die Lichtintensität ist proportional zu der Menge jeweils eingebauter Nucleotide. Die Methode ist besonders gut geeignet zur Analyse kurzer bis mittlerer DNA-Sequenzabschnitte, wie SNPGenotypisierung oder Resequenzierung von speziellen Genen. Die Sequenzierung erfolgt im Gerät in “Echtzeit” und lässt sich so am Bildschirm anhand der erfassten Pyrogramme verfolgen. Das Reaktionsprinzip besteht aus folgenden Schritten: An ein einzelsträngiges PCR Produkt wird ein Sequenzierprimer anhybridisiert. Dazu wird ein Enzym-Substrat-Gemisch gegeben, wobei sich die DNA Polymerase an den Strang anlagert. Nun wird ein Nukleotid angeboten – ist es komplementär zu dem folgenden Nukleotid auf der DNA-Vorlage, wird es von der DNA-Polymerase eingebaut. Durch den erfolgreichen Nukleotideinbau wird eine proportionale Menge Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Dadurch wird die enzymatische Kaskade gestartet. Mittels ATP-Sulfurylase und Pyrophosphat wird dADP zu dATP umgebaut. Mit dem dATP wird in Anwesenheit von Luciferase Luciferin zu Oxiluciferin oxidiert. Das dabei freiwerdende Licht wird von einer CCD-Kamera („charge-coupled device“) erfasst und die Lichtintensität in einem so genannten Pyrogramm dargestellt. Unverbrauchte Nukleotide werden durch Apyrase degradiert. Das nächste Nukleotid kann nun hinzugegeben werden. Da das zugegebene Nukleotid bekannt ist, kann die Sequenz bestimmt werden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 21 - Die Reihenfolge der Nukleotidzugabe wird für jede Sequenzierreaktion zuvor festgelegt und als „Dispensationorder“ bezeichnet. Die Dispensierreihenfolgen können für spezielle Untersuchungen von entscheidender Bedeutung sein. Durch verschiedene Dispensierreihenfolgen können gleiche Sequenzen unterschiedliche Pyrogramme ergeben, insbesondere dann, wenn an heterozygten SNPs nur eins der möglichen Nukleotide bedient wird und somit einer der beiden Stränge nicht verlängert wird (vergl. Abb. 2.3). Für unbekannte Sequenzabschnitte ist eine rotierende Abfolge der vier Basen möglich. 1.4.1. Enzymatische Reaktionskaskade Die Enzymmischung für die Pyrosequencingreaktion enthält DNA-Polymerase (Klenow Fragment, Escherichia coli DNA Polymerase I) ATP Sulfurylase (Saccharomyces cerevisiae) und Luciferase (Photinus pyralis). Die Reaktionskette von der Polymerisation bis zur Detektion des Lichtes dauert bei Raumtemperatur etwa 3-4 Sekunden. Beim Einsatz von einem pmol DNA in der Pyrosequencing Reaktion entstehen bei der Polymerisation 6 ×1011 ATP Moleküle, die in mehr als 6 ×109 Photonen mit einer Wellenlänge von 560 nm umgesetzt werden können. Diese Lichtmenge wird von einer CCD-Kamera detektiert. Um den iterativen Einbau der Nukleotide zu ermöglichen, müssen die übrig gebliebenen Nukleotide aus der Reaktion entfernt werden. Dies geschieht enzymatisch durch die Apyrase. Das Enzym hydrolisiert alle Deoxynukleosidtriphosphate mit ungefähr gleicher Rate. Außerdem hydrolisiert es ATP um eine Anhäufung zwischen den Dispensionen zu vermeiden. Der Nukleotidabbau verläuft langsamer als der Nukleotideinbau durch die Polymerase. Der Einsatz dieses Enzymschrittes ermöglicht den Verzicht auf Waschschritte und die Pyrosequencing Technik im „single-tube“ Verfahren. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 22 - (ssDNA)n + dXTP -Polymerase→ (ssDNA)n+1 + PPi PPi + APS -ATP Sulfurylase→ ATP + SO42- ATP + Luciferin + O2 -Luciferase→ AMP + PPi + Oxiluciferin + CO2 + -Apyrase→ AMP und dXMP + 4 Pi Licht ATP und dXTP Abb. 1.6 - Übersicht über die enzymatischen Reaktionsabläufe während des Pyrosequncing Zur Polymerisation wird kein dATP verwendet, sondern Desoxyadenosinalphathiotriphosphat (dATPaS). dATP ist ein Substrat der Luciferase, während dATPaS zwar von der DNA-Polymerase erkannt wird, jedoch nicht von der Luciferase, was falsche bzw. zu hohe Peaks vermeidet. Die Enzymkinetik der Pyrosequencing-Reaktion kann an Hand der Pyrogramme verfolgt werden. Der Kurvenanstieg ist bestimmt durch die Aktivität der Polymerase und der Apyrase. Das Pyrophosphat (PPi) wird mit Adenosinphosphosulfat (APS) durch die ATP Sulfurylase umgesetzt zu ATP. Die Lichtgenerierung erfolgt durch die Luciferase. Die Reaktionen erfolgen in weniger als 1,7 sec. Die Signalhöhe ist determiniert durch die Aktivität der Luciferase. Der Abfall der Kurve wird bestimmt durch die Effizienz des Nuckleotidabbaus. Die Anhäufung von inhibitorischen Substanzen über die Laufzeit reduziert die Effizienz der Luciferase und der Apyrase. So inhibiert die Akkumulation von AMP und dAMPaS die Aktivität speziell der Luciferase. Die Aktivität der ATP-Sulfurylase bleibt weitgehend konstant. Damit sind die kritischen Reaktionen die DNA-Polymerisation (aufsteigende Kurve) und die Nukleotid-Degradation (abfallende Kurve), die miteinander konkurrieren. Kleine Veränderungen in der Kinetik dieser Reaktionen haben eine direkte Auswirkung auf die Güte der Sequenzierreaktion. In längeren homopolymeren Abschnitten kann manchmal beobachtet werden, dass die Apyrase Nukleotide zu früh abbaut, bevor die Polymerisation dieser Strecken vollendet Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 23 - werden konnte. Eine erneute Dispensation des entsprechenden Nukleotids kann das Problem lösen. Parameter, die zu Problemen bei längeren Leselängen führen können, sind die ineffizienter werdende Degradation durch die von AMP und dAMPaS inhibierte Apyrase in fortgeschrittenen Zyklen und Verdünnungseffekte. Obwohl bei jeder Nukleotid-Dispension nur etwa 0,22 µl dazu gegeben werden, summieren sich diese Mengen bezogen auf das geringe Gesamtvolumen und führen zu einer deutlichen Verdünnung. Dadurch kann nach längeren Leselängen eine verringerte Enzymeffizienz beobachtet werden. Der Hauptanwendungsbereich des Pyrosequencing liegt in der Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen (single-nucleotide-polymorphisms, SNPs) und in der Kurzstreckensequenzierung. Inzwischen sind fertige Assays („Pyro-Mark“, Biotage, Uppsalla, Schweden), z.B. für verschiedene SNPs und für mikrobiologische Typisierungen kommerziell erhältlich. 1.4.2 Instrumentation Die automatisierte Pyrosequencing Maschine, zu sehen in der Abbildung 1.7, verwendet eine Tintenstrahl-Kartusche mit Kammern für sechs verschiedene Reagenzien zur Dispensation genauer Volumina in eine 96er-Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte wird im Gerät geschüttelt, um eine höchst mögliche Reaktionsrate zu erreichen. Über eine Anordnung von Linsen wird das Licht aus den einzelnen Wells auf den Chip einer CCD-Kamera fokussiert. Die gekühlte CCD-Kamera verfolgt die Lichtentwicklung in den Wells der Platte jede Sekunde, um den exakten Fortschritt der Reaktion zu erfassen. Die Kontrolle über Dispensierreihenfolgen und Darstellung der resultierenden Pyrogramme erfolgt über eine spezielle Software an einem Computerinterface. Weiterentwicklungen sind der Pyrosequencer MA96 und das HSSystem von Pyrosequencing, wobei“MA“ für „multi-application“ und „HS“ für „high sensivity“ steht. Im HS-System sind die Plastik-Kartuschen, die nach mehrmaligem Gebrauch weggeworfen werden müssen, durch Kartuschen aus Metall ersetzt. Die Reaktion läuft in kleineren Volumina ab. Dieses System ist aber für die Anwendung in der SNP-Typisierung limitiert. Sowohl im instrumentellen, als auch im Softwarebereich wird an weiteren Verbesserungen der Pyrosequencing Technik durch die Firma Biotage gearbeitet. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 24 - Abb. 1.7 - Pyrosequencer 96MA mit Kartusche. Der Deckel der Dispensationseinheit ist geöffnet, eine gefüllte Kartusche kann eingebaut werden. Darunter befindet sich die Prozesskammer. 1.5 Aufgabenstellung In der Arbeit sollen Strategien entwickelt werden, wie die Anwendung der Pyrosequencing-Technologie als Alternative und Ergänzung zu bestehenden HLATypisierungsmethoden genutzt werden kann. Es sollen Pyrosequencing-basierte Typisierungsstrategien für die wichtigsten HLA-Loci entwickelt werden. Mit Hilfe der zu den einzelnen Loci erarbeiteten Typisierungsstrategien sollen Anwendungsbeispiele untersucht werden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 25 - 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Geräte DNA Extraktionsroboter GenoM-6, Genovision, Wien; Österreich GenoM-48, Quiagen, Hilden Deutschland PCR-Automaten DNA Engine Dynal Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland Zentrifugen für Strips – Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland für Einzelröhrchen - Eppendorf 5415D, Hamburg, Deutschland Vakuumzentrifuge Speedvac SC100, Savant Instruments, Inc. Farmiongdale, N.Y. Elektrophoresekammern MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland Stromversorgung Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland UV-Illuminationstisch Hoefer, Heidelberg, Deutschland Polariod-Kamerasystem Polaroid, Dreieich-Sprendlingen, Deutschland Waagen Sartorius, Göttingen, Deutschland Thermomixer Eppendorf, Hamburg, Deutschland Heizblock TruTemp, Robbins Scientific, Sunnyvale, CA, USA Spektrophotometer GeneQuant, Biochrom Ltd., Cambridge, England Vortexer Jahnke & Kunkel, Staufen Deutschland Pyrosequencer PSQ96 Pyrosequencing, Uppsalla, Schweden DNA Sequencer ABI, Applied Biosystems, Branchburg, USA SSO-Automat Auto-LIPA, Innogenetics/TECAN, Österreich 2.1.2 Chemikalien und Kits Agarose electrophorese Serva, Heidelberg, Deutschland DNA-Polymerasen: AmpliTaq Applied Biosystems, Branchburg, USA AmpliTaqGold Applied Biosystems, Branchburg, USA Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 26 - PCR-Puffer: GeneAmp 10X PCR BufferII (100 mM Tris-HCL, pH 8,3; 500mM KCl) Applied Biosystems, Branchburg, USA 10X PCR Buffer Invitek (1x NH4-reaction-buffer (16 mM (NH4)2SO4, 50 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% Tween-20) Invitek, Berlin, Deutschland MgCl2 Lösung (25 mM MgCl2) Applied Biosystems, Branchburg, USA MgCl2 Lösung (50 mM MgCl2) Invitek, Berlin, Deutschland Nukleotide (dNTP-Mix, 10mM) Sigma, Seelze, Deutschland One-Phor-All-Buffer PLUS, Amersham Bioscience INNO-LiPA-HLA-DRB1/-DQB1/-B Innogenetics, Ghent, Belgien HLA-Seq-Kits Atria Genetics, San Francisco, CA, USA Olerup SSPTM OlerupSSP AB, Saltsjöbaden, Schweden PSQTM96, SNP Reagent Kit, Pyrosequencing, Uppsala, Schweden PyroGold Reagents, Biotage AB, Uppsala, Schweden HaploPrepTM, HLA-B Kit, Genovision, Wien, Österreich MagAttract DNA Blood M96 Kit, Quiagen, Hilden Deutschland GenoPrep Cartidge B 200, Genovision, Wien, Österreich 2.1.3 DNA-Proben Genomische DNA wurde mit der vollautomatischen GenoMTM-48 bzw. GenoMTM-6 Arbeitsstation (GENOVISION, Wien, Österreich; Quiagen, Hilden, Deutschland) aus Blut isoliert. Die Extraktionsmethode besteht aus einer Zelllyse mit Hilfe chaotropher Reagenzien, Bindung der DNA an mit Silikat überzogene, magnetische Partikel gefolgt von der Elution der gereinigten Nukleinsäure in wässriger Lösung. Die Isolationen erfolgten in den Arbeitsstationen, in Kombination mit den dazu gehörigen Kits, für den GenoMTM-48 mit dem „MagAttract DNA Blood M96 Kit“ und für den GenoMTM-6 mit der „GenoPrep Cartidge B 200“ der Firma Qiagen. Die DNA-Konzentration wurde photometrisch mit dem „GeneQuant“ (Biochrom Ltd., Cambridge) bei 260 nm unter Abzug der Beads-Adsorption bei 320 nm bestimmt. Die Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 27 - DNA wurde in wässriger Lösung bei 4°C gelagert. Längerfristig nicht benötigte Proben wurden bei –20 bis –80°C aufbewahrt. Zur Etablierung und Optimierung der Pyrosequencing Methode wurden Standard-DNAProben des Labors verwendet, deren HLA Genotypen bekannt sind. Zu Evaluierungszwecken wurden DNA Proben des Ringversuchs „Deutscher Zell Austausch“ (DZA) 2002, 2003 und 2004 untersucht. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit DNA-Proben von Patienten (Alopecia), gesunden Kontrollpersonen (freiwillige Blutspender) und DNA-Proben von Bewohnern aus Papua Neuguinea (PNG) vom Stamm der Roro untersucht. Tabelle 2.1 – Verwendete DNA-Kollektive DNA-Kollektiv Herkunft Beschreibung Anzahl Familien-Trios Uni Kiel Trio-Platte, 90 Jochen Hampe 30 Familien Uni Antwerpen Alopecia-Patienten Alopecia 161 Bettina Blaumeiser Kontrollen Schiefenhövel, Personen vom Stamm 22 PNG Roro 165 der Roro, PNG 2.2 Methoden 2.2.1 HaploPrepTM HaploPrepTM (Genovision, Wien, Österreich) ist eine Methode zur Separierung von haploiden Sequenzabschnitten der HLA-Region aus genomischer, diploider DNA. Bisher sind HaploPrep-Sonden für die Genorte HLA-A und HLA-B kommerziell erhältlich. Zur Durchführung der Haplotyp-spezifischen Extraktion (HSE) muß zumindest eine grobe Vortypisierung der zu untersuchenden Probe vorangegangen sein. Anhand der ermittelten Allelgruppen können spezifische Sonden ausgewählt werden, welche jeweils nur zu einem der beiden Allele komplementär sind. Diese biotinylierten Sonden hybridisieren an die denaturierte DNA. Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel werden zugegeben und lagern sich an die Biotin-markierten Sonden an. Die Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung HSE-Produkte können dann anschließend - 28 in verschiedensten HLA- Typisierungmethoden eingesetzt werden. Standard-Ansatz für eine HaploPrep-Extraktion: 15 µl HaploPrep Hybridisations-Puffer 8,5-13,5 µl DNA in wässriger Lösung (mindestens 300 ng DNA) 1,5 µl HaploPrep Extraktionssonde ad 30µl H2O (je nach eingesetztem DNA-Volumen) Die Komponenten werden wie oben beschrieben in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß zusammen pipettiert und gemischt. Zur Hitzedenaturierung werden die Proben dann für 15 Minuten bei 95°C inkubiert. In der Zwischenzeit wird der GenoM-6 mit HaploPrep Kartuschen bestückt und gestartet. Dadurch wird der integrierte Heizblock auf die Hybridisierungstemperatur von 64°C vorgeheizt. Nach der Hitzedenaturierung werden die geöffneten Reaktionsgefäße in den GenoM-6 gestellt und der Lauf gestartet. Die Proben werden im Gerät zunächst für 20 Minuten bei 64°C inkubiert, wobei die biotinylierten Sonden an die entsprechenden DNA-Abschnitte hybridisieren sollen. Im Anschluss an diesen Schritt, werden die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Partikel dazugegeben. Es folgen mehrere Waschschritte. Zum Ende des Laufes werden die magnetischen Partikel mit nun gebundenen DNA-Fragmenten in ein Reaktionsgefäß eluiert und können dem Gerät entnommen werden. Die so erhaltene Suspension kann nun direkt in einer anschließenden PCR eingesetzt werden, wobei das Suspensionsvolumen maximal 20% des Reaktionsvolumens betragen sollte. Alternativ können die magnetischen Partikel nach einer zehnminütigen Hitzedenaturierung bei 75°C abgetrennt werden. Dazu wird das Reaktionsgefäß direkt nach der Hitzeinkubation an einen Magneten gestellt und der klare Überstand zum Einsatz in PCR Reaktionen abgenommen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 29 - Abb. 2.1 - Geno M-6 Gerät zur vollautomatischen Extraktion von DNA aus Blut und zur Anwendung der Haplotyp-spezifischen Extraktion. 2.2.2 PCR-Reaktionen Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) (Mullis, 1986) ist nach nur knapp zwei Jahrzehnten seit ihrer ersten Entwicklung und Erprobung zum praktisch unverzichtbaren Standard in der molekulargenetischen Forschung und Diagnostik geworden. Das Prinzip beruht darauf, dass ein definierter Sequenzabschnitt durch spezifische Oligonukleotide, die so genannten Primer, eingegrenzt und dann mit Hilfe einer hitzstabilen DNA-Polymerase vervielfältigt wird. Durch den wiederholten Umlauf durch Denaturierungs-, Annealing- und Elongationstemperatur erreicht man eine Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 30 - Anreicherung des gewünschten Sequenzabschnittes von bis zu einer Million aus der eingesetzten DNA. Für jedes Primerpaar müssen die Bedingungen der PCR Reaktion optimiert werden. Variable Größen sind z.B. der verwendete Puffer, die Art der Taq-Polymerase, die Magnesiumkonzentration aber auch das Temperaturprofil des PCR-Programms. Hierbei unterscheidet man zwischen normalen Programmen, bei denen nach der Denaturierungsphase immer wieder die gleiche Annealingtemperatur angefahren wird und sogenannten touch-down-Programmen, bei denen in den ersten Zyklen hohe Annealingtemperaturen angefahren werden, welche dann in späteren Zyklen abgesenkt werden. Für bestimmte Anwendungen ist der Einsatz von TaqGold sinnvoll. TaqGold besteht aus einem Gemisch von DNA-Polymerase und einem Inhibitor. Die durch die Inhibitorbindung inaktivierte Taq-Polymerase muss durch einen initialen Denaturierungsschritt zu Beginn der PCR (95°C, 10 Minuten) aktiviert werden. Die genauen PCR-Bedingungen werden in den jeweiligen Abschnitten im Ergebnisteil angegeben. 2.2.3 Gesamtgenom Amplifikation Die DNA Amplifikation des Gesamtgenoms (engl.: whole genome amplification, WGA) dient dazu, geringe Mengen DNA zu vervielfältigen und so die Anzahl durchführbarer Untersuchungen bei eingeschränktem Ausgangsmaterial zu erhöhen. Dazu gibt es verschiedene Methoden, die als Kits von unterschiedlichen Herstellern bezogen werden können. Die bekanntesten Strategien sind DOP-PCR („degenerate oligonucleotide-primed PCR“), PEP („primer extension preamplification“) und MDA („multiple displacement amplification“) (Dean et al., 2002). Das hier verwendete Kit „REPLI-g“ (Quiagen) arbeitet nach der „multiple displacement amplification“ (MDA). Diese Methode beruht auf einer „rolling-circle“-Amplifikation zu der exonukleasestabile Zufallshexamere als Primer und f29 DNA Polymerase eingesetzt wird. Dabei entstehen DNA Kopien mit ca. 10-70 kb Länge und einer uniformen Verteilung über das gesamte Genom. Das REPLI-g Kit besteht aus den Komponenten REPLI-g DNA Polymerase, „4x Mix“ mit Primern und Puffer und der „Solution B“ welche den Denaturierungsschritt stoppt. Weiter wird die so genannte „Solution A“ zur Denaturierung benötigt, welche immer frisch aus 40 µl 5M KOH, 10 µl 0.5M EDTA (pH 8) und 450 µl dH2O hergestellt Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 31 - werden soll. Zur Durchführung werden die zu vervielfältigenden DNA Proben in Cycler-Strips vorgelegt und mit TE Puffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) auf ein Volumen von 2,5 µl aufgefüllt. Der empfohlene Input liegt bei ca. 10 ng DNA. Die Solution A wird 1:8 in dH2O verdünnt und es werden jeweils 2,5 µl zu der vorgelegten DNA pipetiert und 3 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Die Solution B wird 1:10 in H2O verdünnt und nach Ablauf der 3 Minuten Denaturierung werden 5µl zur Reaktion gegeben, um die Lösung zu neutralisieren. Der Amplifikations-Master Mix setzt sich aus REPLI-g 4x Mix, REPLI-g DNA-Polymerase und Wasser zusammen. Reagenz µl für 1 Probe DNA in TE 2,5 Solution A (1:8) 2,5 Solution B (1:10) 5 dH2O 27 REPLI-g 4x Mix 12,5 Master- REPLI-g DNA- 0,5 Mix Polymerase total Volumen 50 Zu der denaturierten DNA wird 40 µl Master-Mix gegeben, so dass ein Endvolumen von 50 µl erreicht wird. Das Reaktionsgefäß wird in einen Heizblock oder Cycler gestellt und für 8-16 h bei 30°C inkubiert. enzymatische Dann wird die Reaktion durch ein Aufheizen auf 65°C für 3 min beendet. Die resultierende REPLI-DNA-Lösung soll etwa 900 ng/µl DNA enthalten und sollte wie genomische DNA bei 4°C oder im Tiefkühler gelagert werden. 2.2.4 PyrosequencingTM Das Prinzip des Pyrosequencing wurde schon in der Einleitung ausführlich beschrieben. Es handelt sich um eine DNA-Sequenziermethode, bei der entlang eines einzelsträngigen PCR Produktes der als Vorlage dient, der komplementäre Strang aufgebaut wird. Zunächst muß das PCR-Produkt aufgereinigt und einzelsträngig gemacht werden. In einer 96well-Platte werden dazu 33µl 2x BW Puffer (10mM Tris-HCl (pH 7,6), 2 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20) + 8µl Streptavidin-beschichtete „Dynabeads“ vorgelegt. Dazu wird 20-25µl PCR Produkt gegeben und die Platte für 15 Minuten bei 65°C inkubiert, dabei erfolgt die Anlagerung der biotinylierten PCR-Produkte an die Beads. Mit dem „Pyrosequencing Sample Prep Tool“, einem Werkzeug mit 96 magnetischen Stäbchen, über die ein passendes Plastikutensil gestülpt wird, können die magnetischen Dynabeads mit den angelagerten PCR Produkten aus der ersten Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 32 - Inkubationsplatte entnommen werden. Die DNA-beladenen Beads werden so in eine zweite Platte überführt, welche je 50µl 0,5 M NaOH Lösung enthält. Dort werden sie etwa 1 Minute lang unter leichtem Rütteln inkubiert und das PCR Produkt denaturiert. Danach werden die Beads auf dem gleichen Weg wieder entnommen und in eine Platte mit 100µl AB Puffer (20 mM Tris (pH 7,6), 5 mM Magnesiumacetat Tetrahydrat [(CH3COO)2Mg 4H2O]) überführt und so gewaschen. Nun werden sie mittels des „Sample Prep Tools“ in eine vierte Platte mit 45µl AB Puffer und 5µl Sequenzierprimer (10-20 pmol) überführt und für 2 bis 5 Minuten bei 80°C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Platte in den Pyrosequencer gestellt. Eine Kartusche wird mit Nukleotiden, Enzym-Mix und Substrat befüllt und in die entsprechende Vorrichtung im Pyrosequencing Gerät eingebaut. Über die Gerätesteuerungssoftware werden die Einzelheiten des Laufes, wie Probennamen und gewünschte Dispensierreihenfolgen eingegeben und der Lauf gestartet. Das Gerät verteilt in alle Wells der zu untersuchenden Platte nun zunächst 5,5 µl Enzym– und Substratlösung. Dann werden die Nukleotide, in jedem Schritt 0,22µl, entsprechend der vorher festgelegten Dispensationsreihenfolge (näheres unter 3.1) dazu pipettiert. Der Fortschritt der Reaktion lässt sich anhand der Pyrogramme am Bildschirm in Echtzeit verfolgen. Nach Abschluss des Laufes können die Pyrogramme ausgedruckt und ausgewertet werden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 33 - Abb. 2.2 - Pyrosequencing Aufreinigungszubehör. Links das „Sample Prep Tool“ mit 96 magnetischen Stäbchen zur Separation der Dynabeads aus der Lösung, rechts die Halterung für die vier Platten. Modifikationen des PCR-Produktes durch Blockierung des 3’-Endes Eine Möglichkeit die Formierung von Template-Loops während des Pyrosequencing zu vermeiden, ist die Blockierung des 3’-Endes des PCR-Produktes (Utting, 2004). Dazu wird das einzelsträngige PCR-Produkt mit Terminaler Transferase (TdT, terminal deoxynucleotedyl transferase) behandelt und ein Didesoxynukleotid am 3’ Ende eingebaut. Dieser Schritt erfolgt gegebenenfalls nach der Denaturierung der DNA. Die beladenen Dynabeads werden in 50µl Reaktionsmischung aus 1x One-Phor-All-Buffer mit 0,5 mM ddCTP und 2,5 U TdT für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann werden sie wiederum in 100µl AB-Puffer gewaschen und weiter wie oben beschrieben für das Pyrosequencing eingesetzt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 34 - Herangehensweise bei der Erarbeitung einer spezifischen Pyrosequenzierung Die Sequenzierprimer werden so gelegt, dass sie sich in einem konservierten Bereich befinden, ihr 3’-Ende aber kurz vor einer zu untersuchenden polymorphen Position liegt. Bei der Auswahl der Sequenzierprimer wurde das Programm „SNP primer design“ von Pyrosequencing benutzt (SNP primer design, PyrosequencingTM AB, Version 1.0.1., online). Zur Erstellung der Dispensierreihenfolgen müssen alle möglichen Kombinationen von Allelen berücksichtigt werden. Sie wurden zunächst ohne die Hilfe eines Computerprogramms erstellt. In der Abbildung 2.3 werden Beispiele für die theoretischen Pyrogramme von drei heterozygoten Sequenzmotiven gezeigt. Die zu untersuchende Sequenz ist G (T/C) (T/A) CCAG. Um zu verdeutlichen wie wichtig die Dispensierreihenfolge ist, sind zum Vergleich die Pyrogramme der gleichen Sequenzkombinationen in den beiden Abbildungen mit zwei unterschiedlichen Dispensierreihenfolgen (Basenreihenfolge vertauscht) dargestellt. Eine Veränderung in der Reihenfolge kann, wie im Beispiel gezeigt, dazu führen, dass die unterschiedlichen Stränge verschieden verlängert werden. So können die Sequenzierungen „aus der Phase“ geraten, der Strangaufbau eines Alleles hinter dem des anderen zurück bleiben und so das Pyrogramm nicht mehr oder nur schwer auswertbar machen. Zur besseren Auswertbarkeit, werden in die Dispensierreihenfolgen deshalb bewusst „NullPositionen“ eingefügt, also Basen dispensiert, welche an der betreffenden Stelle bekanntermaßen nicht vorkommen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung G C T A - 35 - C A G CC A G C A G GTA GTT GTA GCT GTT GCT G G (T/C) (T/A) T C A GTA GTT GTA GCT GTT GCT Abb. 2.3 – Oben - Die drei unterschiedlichen Kombinationen der Sequenzmotive erzeugen drei deutlich unterschiedliche Pyrogramme. Die Nukleotidstränge werden gleichmäßig verlängert. Unten - Oberste Kombination (GTA/GTT): Die Stränge werden ungleichmäßig verlängert. Während der GTT-Strang schon die vierte und fünfte Position eingebaut hat, ist der GTA-Strang erst an der dritten Basenposition. Mittlere (GTA/GCT) und untere Kombination (GTT/GCT): Es wird nach der Dispensation der Cs kein T angeboten. Der GCT-Strang wird nicht weiter verlängert. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 36 - Die zu Beginn der Arbeit verfügbare Software der Firma Pyrosequencing, war nicht in der Lage, Vorschläge für eine gegebene Sequenz mit mehr als einer polymorphen Position zu machen (nur für dialleleische SNPs geeignet). Daher wurden die Dispensierreihenfolgen alle ohne Computerunterstützung erstellt. Die inzwischen aktualisierte Softwareversion PSQTM96MA 2.1.1 erlaubt die Eingabe von mehreren di-, tri- und tetra-allelischen SNPs. Die Anzahl der SNPs für die eine geeignete Dispensationsorder und die zugehörigen theoretischen Histogramme berechnet werden kann, ist durch die Rechenleistung des Computers begrenzt. Erfahrungsgemäß können in angemessener Zeit die Kombinationen für bis zu 7 polymorphe Basenpositionen berechnet werden. So wurden im Nachhinein die manuell erstellten Dispensierreihenfolgen nochmals überprüft und teilweise verändert. 2.2.5 HLA-Typisierungsmethoden Zur Überprüfung von Ergebnissen der HLA-Typisierung mittels Pyrosequncing von unbekannten Proben wurden verschiedene kommerziell erhältliche Typisierungskits eingesetzt. Je nach gewünschter Auflösung und Fragestellung wurden eine oder mehrere der hier genannten Methoden benutzt. INNO-LiPA-SSO Die Typisierung mit Sequenz-spezifischer Oligohybridisierung mit INNO-LiPA-Kits beginnt mit der Amplifikation der zu untersuchenden Exone mittels PCR-Mastermix, wobei biotinylierte Amplifikate entstehen. Diese werden chemisch denaturiert und mit spezifischen Oligonukleotidsonden hybridisiert, die sich als parallele Banden auf Membanstreifen befinden. Die Hybridisierungsreaktion, die anschließenden stringenten Waschschritte und die Färbereaktion mittels alkalischer Phosphatase und einem Chromogen erfolgen im Auto-LiPA-Gerät. Die Auswertung der Bandenmuster erfolgt durch einscannen der Membranstreifen und Evaluation durch das zugehörige Programm LiRASTM. Sequenzierung-basierte Typisierung (SBT) Zur Sequenzierung wurden die allele SEQR HLA Sequncing Kits der Firma Atria Genetics benutzt. Die zu untersuchenden Genabschnitte werden mit einer PCRAmplifikationsmischung im Thermocycler vermehrt. Das Amplikon wird durch Zugabe Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 37 - von Exonuclease und alkalischer Phosphatase (ExoSAP-IT®) behandelt, um überschüssige Primer und dNTPs zu entfernen und dient anschließend als Vorlage bei der Sequenzierreaktion mit speziellen Sequnzierprimern und BigDyeTM Terminatoren. Anschließend erfolgen eine Ethanolfällung und eine Detektion im automatischen DNASequncer. Die Auswertung erfolgt über eine spezielle Software zur Allel-Typisierung (Assign SBT, Conexio Genomics). Sequenz-spezifisches-Priming (SSP) Die „Olerupp SSP“-Kits enthalten, vorgefertigte PCR-Platten, in denen die verschiedenen spezifischen Primermixe bereits vorpipettiert vorliegen. Mastermix, TaqPolymerase und DNA werden in die Platte pipettiert und nach Herstellerangaben im Thermocycler inkubiert. Die PCR-Reaktionen sollen bei passendem Primer positiv verlaufen, bei nicht passendem Primer negativ. Die PCR-Produkte werden auf ein Agarosegel aufgetragen. Dadurch entsteht auf dem Gel ein Bandenmuster. Die Interpretation erfolgt über das Auswerteprogramm „HELMBERG-SCORE“, wobei die positiven und negativen Reaktionen eingegeben werden. 2.3 Statistische Berechnungen In so genannten Fall-Kontroll-Studien („case-control studies“) werden Patienten mit einer bestimmten Erkrankung oder einem bestimmten Phänotyp mit Kontrollpersonen verglichen, welche nicht von der Erkrankung bzw. dem Phänotyp betroffen sind. In der speziellen Anwendung im HLA-Bereich werden die HLA-Genotypen der Probanden ermittelt und dann die entsprechenden Allelfrequenzen in den beiden Gruppen mit einander verglichen. Der statistische Vergleich zwischen Patienten und Kontrollen erfolgt mit einer “Vierfeldertafel-Analyse”, für jedes untersuchte Antigen. Dabei werden Werte für die Stärke der Assoziation und der statistischen Signifikanz berechnet. Die Stärke wird beschrieben durch das relative Risiko (Kreuzprodukt Quotient). Dieser Risikowert beschreibt, um wie viel Mal häufiger die Krankheit bei Personen auftritt, die das entsprechende Antigen besitzen, als bei denen, die es nicht haben. Ist ein Antigen präsent bei allen, oder fehlt es bei allen Patienten, wird das relative Risiko so nicht berechenbar, man verwendet dann die „Haldanes Modifikation“. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 38 - Anzahl der Individuen Kontrollen Patienten Total HLA-XY positiv a b a+b HLA-XY negativ c d c+d Total a+c b+d N=a+b+c+d Relatives Risiko: Woolf x = ad bc Haldanes x = (a + 1 )(d + 1 ) 2 2 1 )(c + 1 ) (b + 2 2 Die statistische Signifikanz einer Assoziation kann zum Beispiel über Fishers exakten Test oder den Chi-Quadrat Test bewertet werden. Der Fisher Test ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, Unterschiede zwischen den Werten wie den ermittelten oder größer zu finden. Er ist aber nur zuverlässig, wenn eine der Zahlen in der Vierfeldertafel kleiner als fünf ist, kann aber für größere Probenanzahlen angepasst werden. Sind die zu erwartenden Zahlen größer als fünf ist der Chi-Quadrat Test ausreichend. Gelegentlich wird die Yates Korrektur für Diskontinuität verwendet in dem man den Nenner durch ([ad – bc] – N/2)²N ersetzt. Diese Stetigkeitskorrektur für ChiQuadratwerte empfiehlt sich vor allem für kleine Stichproben, da nur ganze Zahlen in die Vierfeldertafel eingetragen werden. Bei Werten um 100 macht die Abweichung um 1 nur etwa 1% aus, bei einem Wert von 5 macht eine Abweichung von 1 aber 25% aus. In der Literatur finden sich unterschiedliche Angaben, unter welcher Stichprobengröße sie verwendet werden sollte. Für die Berechnungen in dieser Arbeit wurde sie immer verwendet, wenn einer der Werte der Vierfeldertafel kleiner oder gleich 5 war (nach den Empfehlungen von Tevfik Dorak, Workshop, BSHI 2002 Meeting). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 39 - Signifikanz, Fishers exakter Test: P= a!b!c!d ! N ! (a + b)!(c + d )!(a + c)!(b + d )! Chi Quadrat (mit einem Freiheitsgrad) χ² = (ad − bc)² N (a + b)(c + d )(a + c)(b + d ) Chi Quadrat mit Yates Korrektur χ² = (ad − bc)² N ([ad - bc] - N/2)²N Die Testung einer Signifikanz ist wichtig, weil das relative Risiko hoch sein kann, aber wenig signifikant (bei geringer Anzahl Patienten und/oder Kontrollen) und umgekehrt, bei einer großen Probenanzahl kann ein Risikowert, welcher nur relativ wenig Abweichung zeigt, hochsignifikant sein. Oft werden Studien dahin gehend konzipiert, dass die Anzahl der Kontrollen genauso groß ist wie die Anzahl der Patienten. In vielen Fällen ist es aber auch angezeigt, eine möglichst hohe Anzahl von Kontrollen zu haben, da dies eine genauere Berechnung der normalen Allelfrequenzen in der Bevölkerung erlaubt und die statistische Signifikanz einer Assoziation erhöhen kann. So können populationsspezifische Marker erkannt und eingeordnet werden. Werden in einer Studie mehrere Loci an Patienten und Kontrollen untersucht und verglichen kann schnell zufällig eine „signifikante“ Abweichung am 5%-Wert an einem der Loci auftreten, obwohl kein wirklicher Unterschied besteht. Dieses Phänomen, welches auch als Typ I oder Alpha-Error bezeichnet wird, kann umgangen werden, in dem man die P-Werte mit der Anzahl der untersuchten Loci multipliziert. P-Werte können nach folgendem Schema gewertet werden: 0,05 > P > 0,01 eventuell signifikant 0,01 > P > 0,001 signifikant P < 0,001 hoch signifikant Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 40 - Ein P-Wert von 0,05 bedeutet, dass die beobachtete Abweichung in einem von 20 Zufallstests gefunden werden würde, obwohl es keinen Zusammenhang gibt und „eins von zwanzig“ ist kein seltenes Ereignis. Folge- und Zweitstudien sind ein guter Weg Assoziation zu bestätigen oder auszuräumen. Zur Berechnung der statistischen Werte wurde das Vierfeldertafel-Skript der Universität Münster verwendet, zu finden unter: http://medweb.uni-muenster.de/institute/imib/lehre/skripte/biomathe/bio/vierf.html In die Eingabemaske werden die entsprechenden Zahlen eingetragen, die Berechnung der Werte erfolgt dann mit Hilfe eines Javaskriptes.1 Abb. 2.4 - Screenshot der online Applikation „Vierfeldertafel-Analyse“ der Universität Münster 1 Dieses Javascript (ohne den exakten Fisher-Test) stammt von Prof. J.C. Pezzullo, http://members.aol.com/johnp71, Georgetown University, USA. Die englische Originalversion ist unter der folgenden URL zu finden (http://members.aol.com/johnp71/ctab2x2.html). Die relativ ungenaue Approximation zur Berechnung des p-Werts für einen gegebenen Chi-Quadrat-Wert mit einem Freiheitsgrad (Quadrat der Standardnormalverteilung) wurde durch ein Javascript von William Knight, University of New Brunswick - Canada für die Normalverteilung ersetzt. In der Originalversion sind die Ergebnisse für Sensitivität/Spezifität und Positiver/Negativer Prädiktiver Wert vertauscht. Dies wurde korrigiert. Die Konfidenzintervalle für Odds Ratio und Relatives Risiko werden nach der iterativen Methode von Gart/Cornfield berechnet. Eine Darstellung dieser Methode befindet sich im Buch von Fleiss, JL. Statistical Methods for Rates and Proportions. Wiley 1981. In der Originalversion wird diese Methode fälschlicherweise auch zur Berechnung der Konfidenzintervalle für die Sensitivität, Spezifität, Positiver und Negativer Prädiktiver Wert benutzt. Wir berechnen stattdessen für diese Größen das exakte Konfidenzintervall für binomialverteilte Anteilswerte. Das Javascript zur Berechnung des exakten Fisher Tests stammt von Øyvind Langsrud, MATFORSK, Norwegian Food Research Institute, http://www.matforsk.no/ola. Der Link zur englischen Originalversion befindet sich hier (http://www.matforsk.no/ola/fisher.htm). Die deutsche Version stammt von Wolfgang Köpcke Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 41 - 3. Ergebnisse Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Pyrosequencing-Strategien für die Typisierung von hochpolymorphen HLA-Genorten zu entwickeln. Begonnen wurde mit dem Genort HLA-DQB1, da dieser Lokus mit rund 60 bekannten Allelen im Vergleich zu anderen wichtigen funktionelen HLA-Loci der mit der geringsten Polymorphie ist. Der deutlich komplexere Genort HLA-DRB1 schloss sich an. Dieser Lokus ist mit über 400 Allelen wesentlich polymorpher und durch die Vielzahl von verwandten funktionellen Genen sowie Pseudogenen komplizierter zu analysieren. Die Sequenzstruktur erlaubt aber eine recht übersichtliche Gruppeneinteilung. Abschließend wurde der polymorphste HLAGenort, der Klasse I Genort HLA-B bearbeitet, für den über 700 Allele in der Datenbank zu finden sind. Die Entwicklung einer Pyrosequencing basierten Strategie für den Klasse I Locus HLA-A wurde im Rahmen einer Diplomarbeit bearbeitet. Begonnen wurde für jeden der Loci jeweils damit, geeignete PCR-Primer zu erstellen und praktisch zu testen. Parallel dazu wurden Sequenzierprimer in konservierten Sequenzbereichen erstellt und geeignete Dispensierreihenfolgen für das Pyrosequencing formuliert. 3.1 HLA-DQB1-Typisierung Die Prozedur besteht aus den folgenden Stufen: 1. Generische Amplifikation der DQB1-Exon 2-Region 2. Aufreinigung und Denaturierung der amplifizierten Template DNA zur ssDNA 3. Pyrosequenzierung verschiedener polymorpher Bereiche 4. Auswertung der Pyrogramme 5. Gegebenenfalls zusätzliche Amplifikation des Exon 3 und Pyrosequenzierung Für die Amplifikation des Exon 2 des Genortes HLA-DQB1 wurden verschiedene Vorwärts- und Rückwärtsprimer getestet. Die Kombination der Primer DQB-AmpB-F und DQB-Amp-INT-R ergaben PCR-Produkt von 260 bp Länge welches in der nachfolgenden Sequenzierung zu intensiven Pyrosequencing Signalen führt. Das Amplifikat wird in 5 Pyrosequencing Schritten sequenziert. Zusätzlich besteht die Möglichkeit das Exon 3 zu amplifizieren und mittels zwei Sequenzierschritten zu untersuchen. Ein weiterer Sequenzierprimer im Exon 2 kann im Falle der Amplifikation mit alternativen, im Intronbereich liegenden Primern eingesetzt werden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 42 - 2DQBAmp-B-F DQBEx3-F DQBAmp-INT-F Exon 2 Exon 3 DQBEx3-R DQB-AMP-INT-R2 PCR-Produkt 260 bp PCR-Produkt 199 bp Pyrosequncing Pyrosequncing S-119* S-500* S-159 S-599* S-201 S-229 S-294 S-346 Abb. 3.1 - Schematische Darstellung der Pyrosequencing-basierten Typisierungsstrategie für die polymorphem Regionen Exon 2 und 3 des HLA-DQB1 Genortes. Die mit Sternchen markierten Sequenzierprimer werden nur in bestimmten Fällen zur Untersuchung benötigt. In der Abbildung 3.1 sind diese Schritte schematisch dargestellt. Zur Auswertung der Typisierung wurden die Pyrogramme mit den bekannten Allelsequenzen verglichen. Zu diesem Zweck wurden Auswertebögen mit den Sequenzen und polymorphen Positionen erstellt. Durch die Auswertung des Pyrogramms des Sequenzierprimers S-346 lässt sich eine grobe Einteilung der DQB1-Allele in Gruppen vornehmen. Um dann die AllelGruppen genauer aufzulösen, werden die Informationen aus weiteren Pyrosequencingschritten einbezogen (siehe Abb. 3.2). Aus den Sequenzinformationen werden die in Frage kommenden Allele ausgewählt, nicht passende Allele werden ausgeschlossen. Die meisten Allelkombinationen können durch die Analyse des Exon 2 erfolgreich untersucht werden. Nur zur Auflösung der Allele HLA-DQB1*0201 und *0202 und HLA-DQB1*0301 und *0309 liegen entscheidende polymorphe Informationen im Exon 3, so dass eine Amplifikation des Exon 3 nötig ist. Die Sequenzierprimer wurden so gelegt, dass sie in konservierten Regionen der DQB1 Region liegen, ihr 3’-Ende aber kurz vor einem zu untersuchenden Polymorphismus liegt. Bei der Erstellung der Dispensationsreihenfolgen wurden alle Kombinationen der bis dato bekannten DQB1-Allele berücksichtigt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 43 - DNA HLA-DQB1 Typing Scheme PCR HLA-DQB1 (EXON 2) PCR Product 260 bp Pyro DQB1-S-346 DQB1*02/*03/*04 DQB1*05 Pyro DQB1- S-159 A Base position 159 DQB1*02 Pyro DQB1- S-229 DQB1*0501, *0502, *0503 C DQB1*04 DQB1*0601-03 G DQB1*03 Pyro DQB1- S-159/ S-294 DQB1*0604-09 Pyro DQB1- S-159/ S-228 Pyro DQB1-S-159 Base position 164 DQB1*0401 T DQB1*0402 G PCR Exon3 Pyro DQB1-S-500 Pyro DQB1S-159/S-229 Abb. 3.2 - HLA-DQB1-Schema. Durch den Sequenzierungsschritt mit dem Sequenzierprimer DQB-S346 lässt sich eine Zuordnung des untersuchten Allels in eine der 4 DQB1-Gruppen vornehmen. Durch die weiteren Sequenzierschritte wird weiter aufgelöst. 3.1.1 HLA-DQB1-PCR-Bedingungen Zur Amplifikation des Exon 2 wurden drei Vorwärts- und drei Rückwärtsprimer (Tabelle 3.1) in 5 verschiedenen Kombinationen getestet (Tabelle 3.2). Das beste Produkt mit den intensivsten Signalen ergab sich mit den Primern DQB-AmpB-F und DQB-Amp-INT-R („Kombi5“). Nachteil dieser Primer-Kombination ist, dass der Vorwärtsprimer bereits im Exon 2 liegt, so dass eine Region von 49 Basen Länge nicht durch Pyrosequenzierung untersucht werden kann. Es werden 5 polymorphe Basenpositionen nicht abgefragt, wobei zwei davon keinen Aminosäure Austausch hervorrufen. In Fällen, in denen für eine bestimmte Fragestellung dieser Bereich entscheidend sein könnte, muß eine weitere PCR mit zusätzlichen Primern durchgeführt werden, die im Intronbereich liegen („Kombi3“). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 44 - Tab. 3.1 - PCR-Primer für die HLA-DQB1-Typisierung Name Position Funktion Sequenz Markierung Ex2 2DQBAMP-B-F 135 - 155 PCR-Primer-F CATGTGCTACTTCACCAACGG Ex2 2DQBAMP-B-R 328-348 PCR-Primer-R CTGGTAGTTGTGTCTGCACAC 5'-Biotin Ex2 DQB-AmpF-PYRO 127 - 150 PCR-Primer-F TTTAAGGGCATGTGCTACTTCACC Int1 -14 – DQB-AMP-INT-F Ex2 115 PCR-Primer-F ATTCCTCGCAGAGGATTTCG Ex2 265 bis DQB-AMP-INT-R Int2 +15 PCR-Primer-R GGCGACGACGCTCACCTC 5'-Biotin PCR-Primer-R CTCCTGGCGCAGAGACTT 5'-Biotin Int 2 DQB-AMP-INT-R-2 DQBEx3-F DQBEx3-R 42-59 Ex3 44-63 PCR-Primer-F CAACCACCACAACCTGCTGG Ex3 224-242 PCR-Primer-R CACGTGGCAGGTGTAGACG 5'-Biotin Tab. 3.2 - Getestete Primer Kombinationen für DQB1-Exon2 Kombi1 2DQBAMP-B-F X Kombi3 Kombi4 X 2DQBAMP-B-R Kombi2 DQB-AmpF-PYRO Kombi5 X X X X DQB-AMP-INT-F X DQB-AMP-INT-R X X DQB-AMP-INT-R-2 X Die optimalen Primerkombinationen sind grau unterlegt dargestellt. Die PCRs wurden in einem Maßstab von 25 µl durchgeführt. Die Amplifikationen wurden in Bezug auf Annealingtemperatur und Magnesiumkonzentration optimiert. Die Zusammensetzungen der Reaktionsmischungen sind folgende: Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung PCR: Kombi5 DNA Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen 2-20 ng/µl Gene Amp10xPCR-BufferII, Applied Biosystems 25 mM, Applied Biosystems je 2mM, Sigma 10 mM,DQB-AmpB-F 10 mM, DQB-AMP-INT-R-2 5U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun - 45 µl 3 2,5 1,5 1 0,5 0,5 0,1 15,9 25 PCR-Cycler-Programm: Denatrurierung bei 95°C für 5 Minuten, 40 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden, Annealing Temperatur von 56°C für 30 Sekunden und Elongationsschritt bei 72°C für 90 Sekunden und eine abschließende Elongation von 10 Minuten bei 72 °C. PCR: Kombi3 DNA Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen 2-20 ng/µl Gene Amp10xPCR-BufferII, Applied Biosystems 25 mM, Applied Biosystems je 2mM, Sigma 10 mM,DQB-Amp-INT-F 10 mM, DQB-AMP-INT-R 5U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun µl 3 2,5 3 1 0,5 0,5 0,1 14,4 25 PCR-Cycler-Programm: Denatrurierung bei 95°C für 5 Minuten, 40 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden, Annealing Temperatur von 60°C für 30 Sekunden und Elongationsschritt bei 72°C für 90 Sekunden und eine abschließende Elongation von 10 Minuten bei 72 °C. PCR: Exon 3 DNA Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen 2-20 ng/µl 10x NH4-Buffer, Invitek 50 mM, Invitek je 2mM, Sigma 10 mM, DQB-Ex3-F 10 mM, DQB-Ex3-R 5U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun µl 3 2,5 1 1 0,5 0,5 0,1 16,4 25 PCR-Cycler-Programm: Denatrurierung bei 95°C für 5 Minuten, 40 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden, Annealing Temperatur von 60°C für 30 Sekunden und Elongationsschritt bei 72°C für 30 Sekunden und eine abschließende Elongation von 10 Minuten bei 72 °C. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 46 - 3.1.2 Pyrosequencing von HLA-DQB1 Die speziellen Dispensierreihenfolgen sind in Tabelle 3.3 dargestellt. Nach der Amplifikation des PCR-Produktes erfolgt ein erster Pyrosequencing Schritt mit dem Sequenzierprimer S-346. Durch das Ergebnis dieses Schrittes ist bereits eine grobe Einteilung der vorhandenen Allele in 4 Gruppen möglich. Zur Auflösung der Allele sind dann maximal 4 weitere Pyrosequencing Schritte nötig (Abb.3.2). Die Unterscheidung der Allele DQB1*0201 und DQB1*0202 ist nur an Hand eines Sequenzabschnitts im Exon 3 möglich. Das gleiche gilt auch für die Diskriminierung zwischen DQB1*0301 und DQB1*0309. Das Vorkommen des Allels DQB1*0309 ist in der europäischen Population jedoch extrem selten, lediglich im südostasiatischen Raum wird es mit einer Frequenz von 0,006 in der Datenbank genannt (www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc/MHC.cgi?cmd=init). So wurde die Untersuchung des Exon 3 nur für die DQB1*02 Typisierung eingesetzt. Zur Optimierung des Pyrosequencing schlossen sich Versuche an, bei denen die Menge der eingesetzten Dynabeads, die Menge des eingesetzten PCR-Produktes und der Einsatz von Single-Stranded-Binding-Protein (SSB) variiert wurden. Dieses Protein bindet an einzelsträngige DNA-Stränge und stabilisiert sie, so dass das Anhybridisieren des 3’-Endes verhindert wird. Auch verschiedene Methoden der Aufreinigung und mögliche Modi der Software wurden getestet. Es stellte sich heraus, dass bei schwachen Pyrogrammen wie beiden PCR-Produkten mit den Intronprimern (Kombi 3), durch die Erhöhung der PCR-Produktmenge auf 45 µl und eine Erhöhung der Dynabeads Menge von 8 auf 12-15 µl bessere Ergebnisse erzielt werden konnten. Die Nutzung des SQAModus (Sequenziermodus der Pyrosequencing-Software, nur für homozygote Sequenzen vorgesehen) im Zusammenhang mit einer Streptavidin-beladenen Sepharose zur Aufreinigung ergab keine Verbesserung der Ergebnisse. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 47 - Tab. 3.3 - Sequenzierprimer und Dispensierreihenfolgen für die HLA-DQB1 Typisierung Sequenzierprimer Primer Sequenz (5’-3’) Dispensierreihenfolgen DQB-S-119* CGCAGAGGATTTCGT TGTAGCAGTAGCAT DQB-S-159 CTTCACCAACGGGAC CAGCAGCGCGTGCGTGTCTGTGAGCAGAGCTA DQB-S-201 CATCTATAACCGAGA AGAGTATCGTCAGC DQB-S-229 TCGACAGCGACGTG CGAGCTAGTATCGCAGCTGAGTGACGCTGCATGCT CGCTAGTC DQB-S-294 GGAACAGCCAGAAGGA TCATGTCTGAGAGACGAGCAGTCGTGACACGAGTA DQB-S-346 TGCAGACACAACTAC GCAGTGCAGCTACATCGCACGATCTGCAGACGAC DQB-Ex3-S-500 GGTGGTTTCGGAATG TAGCAGA DQB-Ex3-S-599 AATGACTCCCCAGCA TGCAGACG Insgesamt wurde das HLA-DQB1 Typing für 20 laboreigene DNA Standard-Proben erfolgreich durchgeführt. Des Weiteren wurde das Verfahren an jeweils 20 DNAProben der Ringversuche des DZA aus den Jahren 2002 und 2003 evaluiert. Die Resultate stimmten mit den Ergebnissen der Ringversuche auf dem 4 Stellen Niveau völlig überein. Insgesamt wurden zu Evaluierungszwecken etwa 50 DNA-Proben typisiert und mit früheren Typisierungsergebnissen anderer Methoden verglichen. Dabei wurden 14 verschiedene HLA-DQB1-Allele in verschiedenen Kombinationen blind typisiert, was bei Betrachtung auf vierstelligem Niveau 78% der häufigen (Allelfrequenz > 0,1% in der europäischen, weißen Bevölkerung) Allele entspricht. Die Methode wurde in der Veröffentlichung „New strategies for efficient typing of HLA class-II loci DQB1 and DRB1 by using PyrosequencingTM“ (Entz et al., 2005) zusammen gefasst dargestellt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 48 - 3.2 HLA-DRB1-Typisierung Der DRB1-Genort ist nicht nur deutlich polymorpher als der DQB1-Genort, dazu kommt, dass die HLA-DR-Subregion zusätzliche Gene, nämlich DRB2 bis 9 und DRA enthält, die je nach Haplotyp in unterschiedlicher Anzahl vorliegen können (Abb. 3.3). So besitzt wohl kein Individuum alle 10 Loci, aber alle den DRA-Genort und eine variable Zahl an DRB-Genorten. Bei DRB2, 6, 7, 8 und 9 handelt es sich um Pseudogene. Bei der Primerauswahl muss berücksichtigt werden, dass sich diese Gene von ihrer Sequenz z.T. stark ähneln. Die Erarbeitung der Pyrosequencing Strategie für den HLA-DRB1 Genort gestaltete sich daher anspruchsvoller, als für den HLA-DQB1Genort. Klasse II Klasse III Klasse I HLA-D Region HLA-DP HLA-DQ HLA-DR DR*01-, 10Haplotyp DRB1 DRB6 DR*02-Haplotyp DRB1 DRB6 DR*03-, 05-, 06Haplotyp DRB1 DR*08-Haplotyp DRB1 DR*04-, 07-, 09Haplotyp DRB1 DRB7 DRB3 DRB8 DRB4 DRB9 DRA DRB9? DRB5 DRA DRA DRB9? DRB2 DRB9? DRA DRB9? DRA Abb. 3.3 - Organisation der DR Subregion. Je nach Haplotyp ist eine unterschiedliche Anzahl von DRGenorten präsent. Die nicht exprimierten Pseudogene sind heller gefärbt dargestellt. DRB9 ist mit einem „?“ gekennzeichnet, wenn der Haplotyp das Pseudogen nicht in allen Fällen enthält (nach Tsuji et. al., 1991). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 49 - Die erarbeitete Strategie beinhaltet folgende Schritte: 1. Allelgruppenspezifische Amplifikation zur Vortypisierung 2. Spezifische Amplifikation der einzelnen Allelgruppen 3. Aufreinigung und Denaturierung des amplifizierten Templates zur ssDNA 4. Pyrosequenzierung der polymorphen Bereiche 5. Auswertung der Pyrogramme Aufgrund der Problematik der hohen Alleldiversität des DRB1-Genortes wurde die Sequenzierung mit einer gruppenspezifischen PCR gekoppelt. Dazu wurden bereits mehrfach in der Literatur evaluierte Primerkombinationen auf ihre Eignung innerhalb der Pyrosequencing-Strategie geprüft. Die zu untersuchende DNA-Probe wird mit acht verschiedenen Forward-PCR-Primern (Wu et al., Molecular Diagnosis 1996, siehe Tabelle 3.5) amplifiziert. Das Vorhandensein bzw. nicht-Vorhandensein der PCRProdukte wird dann in einer Gelelektrophorese überprüft. Alternativ dazu kann diese Überprüfung auch nicht-elektrophoretisch mittels PicoGreen Messung (Hampe et al., 2004) erfolgen. Durch die PCR erhält man entweder zwei Fragmente aus verschieden Gruppen, oder ein einzelnes PCR-Produkt, wenn beide Allele des Individuums in der gleichen Gruppe liegen oder das Individuum homozygot für den HLA-DRB1 Lokus ist. Je nach Allelgruppe erfolgen dann 1 bis 7 Pyrosequencing Reaktionen (Abb. 3.5). Die Anzahl der Pyrosequencing Schritte, die notwendige Sequenzierlänge und die damit untersuchten polymorphen Reste sind je nach Gruppe unterschiedlich (siehe Tabelle 3.6). Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 50 - DRB1-Amp1-F DRB1-Amp2-F DRB1-Amp3-2-F DRB1-Amp3-3-F DRB1-Amp4-F DRB1-Amp7-F DRB1-Amp9-F DRB1-Amp10-F DRB1-Amp03-F DRB1-Amp11*-F Exon 2 2DRBAMP-B DRB1-Amp03-R Allelgruppen spezifische PCR-Produkte 122-272 bp Pyrosequencing Abb. 3.4 - Schematische Darstellung der Pyrosequencing-Strategie für HLA-DRB1 HLA-DRB1 Typing Scheme PCR Amp1 PCR Amp2 DNA PCR Amp3-2 PCR Amp3-3 PCR Amp03 DRB1*01 Pyro DRB1S-159 S-220 S-286 S-339 DRB1*15, *16 DRB1*08,*12, *1404 DRB1*04 most DRB1*03 alleles Pyro DRB1S-159 S-220 S-256 S-286 S-339 PCRAmp7 PCR Amp9 PCR Amp10 DRB1*07 DRB1*09 DRB1*10 PCR Amp11 most DRB1 *11 alleles *03, *13, *14 exept for *1404 Pyro DRB1S-159 S-220 S-256 S-286 S-339 PCR Amp4 Pyro DRB1S-159 S-220 S-256 S-286 S-339 Pyro DRB1S-160 S-220 S-256 S-286 S-339 Pyro DRB1S-160 S-256 S-286 Pyro DRB1S-256 Pyro DRB1S-286 Pyro DRB1S-286 S-339 Abb. 3.5 - HLA-DRB1 Typing Schema. Durch die PCR-SSP werden die Allele vortypisiert und in die entsprechenden Gruppen sortiert. Die Pyrosequencing-Reaktionen sind spezifisch auf die jeweilige Allelgruppe angepasst. Fett gedruckte Sequnzierprimer bezeichnen die Schritte, die nötig sind, um mindestens die in der europäischen Population häufigen Allele zu typisieren. Weitere Sequenzierschritte können zu einer höheren Auflösung führen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 51 - 3.2.1 HLA-DRB1-PCR - Allelgruppenspezifische Amplifikationen Die Amplifikationen wurden in einem Maßstab von 25 µl durchgeführt. Die allelgruppen-spezifischen PCR-Reaktionen wurden im Hinblick auf Magnesiumkonzentration und Annealingtemperatur optimiert. Im Falle des Primerpaars, welches zur Amplifikation der DRB1*09-Allele benutzt wird, wurde auf Grund schwacher Amplifikate die normale Taq-Polymerase durch TaqGold-Polymerase ersetzt. Die Zusammensetzung der PCR-Ansätze ist in Tabelle 3.4 aufgelistet. Die Amplifikation erfolgte mit dem folgenden Cycler-Programm: Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten. Für den Ansatz mit dem DRB1-Amp9-Primer mit TaqGold-Polymerase muss der erste Denaturierungsschritt auf 10 Minuten verlängert werden. Dann folgen 40 Zyklen mit jeweils 30 Sekunden Denaturierung bei 95°, Annealingschritt für 30 Sekunden und Elongation für 1 Minute 30 Sekunden bei 72°C. Für die PCR mit DRB1Amp1-F liegt die optimierte Annealingtemperatur bei 56°, für alle anderen Primer bei 60°C. Es folgt eine abschließende Elongation bei 72°C für 10 Minuten. Tab. 3.4 - Optimierte DRB1-SSP-PCR-Ansätze: [µl] Amp1 Amp2 Amp3-2 Amp3-3 Amp4 Amp7 Amp9 Amp10 DNA (mind. 2 ng/µl) 3 3 3 3 3 3 3 3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 2,5 1,5 2,5 2,5 2,5 1 1,5 2,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Buffer Invitek 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 ddH2O 15,6 16,6 15,6 15,6 15,6 17,1 16,6 15,6 25 25 25 25 25 25 25 25 Taq Polymerase (5 U/µl) dNTP´s (10 mM each) 2+ Mg Invitek MgCl2 (50 mM) Primer-F (10 mM) 2DRBAmpB (10 mM) 10xNH4-Reaction- Gesamtvolumen Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 52 - Tab. 3.5 - Primer zur Amplifikation von HLA-DRB1 Primer Name Position Sequenz (5'-3') Länge Spezifität* DRB1-Amp1)1 2DRBAMP-B DRB1-Amp21) 2DRBAMP-B DRB1-Amp3-21) 2DRBAMP-B 6 - 25 TTCTTGTGG(C/G)AGCTTAAGTT 261 bp *01 6 - 26 TTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG 261 bp *15, *16 3 - 25 CGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG 264 bp DRB1-Amp3-31) 2DRBAMP-B 3 - 25 CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTC 264 bp DRB1-Amp41) 2DRBAMP-B DRB1-Amp721 2DRBAMP-B DRB1-Amp921 2DRBAMP-B DRB1-Amp101) 2DRBAMP-B 2DRB-AMP-B3) 4 - 24 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAAC 263 bp *08 außer 0820, *12, *1105, *1317, *1404/11/15/28/31 *03, *0820, *11 außer 1105/22/30, *13 außer 1317, *14 außer 1404/10/11/15/28/31/39 *04, *1410, *1122 8 - 27 CCTGTGGCAGGGTAA(G/A)TATA 259 bp *07 -6 -12 CCCAACCACGTTTCTTGA 272 bp *09 -4 - 15 AGACCACGTTTCTTGGAGG 270 bp *10 247 - 266 CCGCTGCACTGTGAAGCTCT DRB1-Amp03-F DRB1-Amp03-R2) DRB1-Amp3-31) DRB1-Amp03-R2) 75 - 96 207 - 225 3 - 25 207 - 225 TACTTCCATAACCAGGAGGAGA TGCAGTAGTTGTCCACCCG CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTC TGCAGTAGTTGTCCACCCG 151 bp *03 außer *0304/09/11/14/15/17 222 bp DRB1-Amp03-F2) 2DRB-AMP-B 75 - 96 247 - 266 TACTTCCATAACCAGGAGGAGA 191 bp DRB1-Amp11*-F 2DRB-AMP-B 144 - 161 247 - 266 CTGGGGCGGCCTGATGAG 122 bp DRB1*0301-*0310,*0312, DRB1*0313,*0316,*0318-*0323, *0325 , *1107 DRB1*0301-*0303, *0305 -*0308, *0310 - *0318, *0319 -*0320, *0324, *1109, *1116, *1120, *1140, *1301, *1302, *1305, *1306, *1309, *1310, *1315, *1316, 1318, *1320, *1326 *1329,*1331,*1332,*1334,*1335,*1 336, *1339*1343,*1351,*1353,*1402, *1403,*1406,*1409,*1412,*1413,*1 417, *1418, *1419, *1421,*1424,*1427, *1429, *1430, *1433 all *11, *0308, *0415, *1204, *1411 2) * alle Spezifitäten Stand 2003. Primersequenz aus Wu et al. ; 2) Primersequenz aus Olerup et al. ; 3) Primersequenz aus dem IHWG XIthWorkshop Protokoll Die Rückwärtsprimer sind 5’ biotinyliert. 1) Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 53 - 3.2.2 Pyrosequencing von HLA-DRB1 Die Aufreinigung, Denaturierung und das Pyrosequencing erfolgte wie im Methodenteil beschrieben. Zur Optimierung von Pyrosequencing Reaktionen, bei denen Pyrogramme entstanden, die einen starken Hintergrund aufwiesen, wurde zur Qualitätsverbesserung Single-Stranded-Binding-Protein (SSB) zugesetzt. In der Literatur (Ronaghi, Analytical Biochemestry, 2000) wird eine Menge von 500 ng empfohlen. Zur Optimierung der SSB-Menge wurden Versuche mit unterschiedlichen SSB-Konzentrationen vorgenommen (siehe auch Abb. 3.6). Es wurden Mengen von 450 bis 2250 ng SSBProtein pro Ansatz untersucht. Es zeigte sich, dass für diese spezifische Anwendung das Optimum im Bereich von 900 ng SSB pro Ansatz liegt. Die Reaktionen für die die SSBProtein Zugabe empfohlen wird, sind in der Tabelle 3.7 entsprechend gekennzeichnet. Tab. 3.6 – Sequenzierprimer für HLA-DRB1 Seqenzierprimer Position DRB1-S-160 146-158 Sequenz (5’-3’) GGACGGAGCGGGT DRB1-S-220 206-219 TCGACAGCGACGTG DRB1-S-256 243-255 GCTGGGGCGGCCT DRB1-S-286 270-285 GAACAGCCAGAAGGAC DRB1-S-339 322-338 TGCAGACACAACTACGG Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 54 - a) b) c) GA CGCT G A G T A C T GGAACA G CCA GAAGGA C A T CC T Abb. 3.6 - Beispiel für die Unterdrückung des Hintergrundes mit SSB-Protein in verschiedenen Dosen. Amplikon DRBAmp2, amplifiziertes Allel DRB1*1501, mit Sequenzierprimer S-256, ohne SSB-Protein (a), mit 450 ng SSB-Protein (b) und mit 1350 ng SSB-Protein (c) pro Ansatz. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 55 - Tab. 3.7 - Dispensierreihenfolgen Pyrosequencing von HLA-DRB1 Gruppe Amp1 Sequenzierprimer DRB1-S-159 DRB1-S-220 DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 DRB1-S-220 DRB1-S-256 DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 DRB1-S- 220 DRB1-S-256 DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 Amp2 Amp3-2 Amp3-3 Amp3-3 Amp03-R Amp03-F 2DRBAMP-B Amp11 Amp4 Amp9 Amp10 SSB - CAGCAGTA - GCAGTCTGAGCTACGAGCGCGCGCGCTGACACTGACTCG - AGCTCGTGCAGAGCTCA - TGCGTCTGACAGATCGACTCTATATCTAGAGAGTACTG - CGAGTATCGAGTCGTCTGACGAGCT - TGAGTCGCTCGAGTACTGACAGCAGAGAGCATGCTC + CATCTGAGCACGAGCAGCGCGCGCGCTGTGACACTACTGCA + GAGTGTGAGAGC - CGCGTACTGAGCAGATCACTCTATACAGAGAGTGCATCGT + CAGAGTATCGCGTGACAGAGCT + CGACGTCTGCGAGTCACTGACA - GCATCTGAGACAGCGCGCTGTGACAC + CGCTGTGAGAGCTCACAGTGCAGCG - CGCAGTACTGAGCAGATACTCTATACGAGAGAGTAGCATCGT CTG TCGTAGTACTGCGTGACGAGCTGC + + CGAGCTCACGAGCTACTGA + TCAGTCTGAGCAGAGCGCAGTGACACTACTGC + CGCTAGTGAGAGCTCACAGTGCAGCG - TGCGTAGCTGACGCA - DRB1-S-339 CGTGTGCA - DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 TCAGTCTGAGCAGAGCGCAGTGACACTACTGC - GCTGTGAGAG - TGCGTCTGACAGATACTCTATCATCGACGAGCAGTATCGTGCA GCTCGAC CGGAGCGTATCGCTCGTGACTCGAGCT + GAGTCGACGTCGAGTCACATGACTGACA + CATCTGAGCAGCAGAGA - CGTGTGCA - TGCAGTCTGAGTAGCTCTC - DRB1-S-220 DRB1-S-256 DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 DRB1-S-220 DRB1-S-256 DRB1-S-286 DRB1-S-339 DRB1-S-159 DRB1-S-256 DRB1-S-286 DRB1-S-256 DRB1-S-286 Amp7 Dispensationsreihenfolge TGC GTGCTGAGATGCATCT ATACAGAGAGTACGT GATCTAGCGCAGTACATGACAGCAGCAGAC - ATCTGAGACAGCGCAGTGACATACGTGTGCAGA - CGTATCGCTCGAGTACGTG - GCTCTGAGCGAGCGTCTGCGCGT - Wie schon im Abschnitt 2.2.4 beschrieben, ist die Reihenfolge der Basenzugabe wichtig, um ein aussagefähiges Pyrogramm zu erhalten. Die Dispensationsreihenfolgen wurden für jede Allelgruppe speziell erstellt, angepasst an die entsprechenden polymorphen Positionen. Die optimierten Dispensierreihenfolgen sind in Tabelle 3.7 zu finden. Die Auswertung - der Pyrogramme erfolgte mit speziell erstellten Auswertungsbögen. ein Beispiel ist in Abb. 3.7 gezeigt. Für jede Allelgruppe sind dort die zu erwartenden Sequenzen mit variablen Positionen erfasst. Durch Vergleich mit Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 56 - den Pyrogrammen wurden die vorliegenden Sequenzen ausgewertet und mit den bekannten Allelsequenzen aus der Datenbank verglichen. Auswertebogen für DRB-1 – Amp4 DNA-Nr.: Datum PCR: Datum Pyro: Gruppen laut PCR: Amp4 *04, *1410, *1122 S-160 GCGGTTCCTGGACAGATACTTCTAAT(A/C)ACC(A/G)AGA(G/A)GAG(T/A)(A/C/T)CGTGC( G/A)(C/G)TTCGAC S-220 GGGGA(G/C)T(A/T)CCGGG(C/T)GGTGA(C/T)GGAGCT S-256 (G/A)(A/G)(T/C)(G/A)(C/A/G)(C/T/G)(G/C)AG(T/C)ACTGGAACA S-286 (C/A/T)TCCTGGA(A/G)(G/C)(A/G)(C/G)(A/G)(G/A)(G/A) S-339 GG(T/C)TG(G/T)(T/G)GAGAG(C/A)TTCACA Abb. 3.7 - Auswertebogen für die Pyrogramme von Amplifikaten der Allelgruppe DR4 Um die spezielle Vorgehensweise der Feintypisierung innerhalb einer Gruppe und der Auswertung genauer zu dokumentieren, ist in Abbildung 3.8 das Typing-Schema innerhalb der Gruppe DRB1*04 dargestellt. Hier wird mit Hilfe des Sequenzierprimers DRB1-S-256 das Sequenzmotiv an den Basenpositionen 256-259 untersucht. Während die Motive „GAC“ und „AGC“ bereits eine genaue Allelzuordnung zu lassen („AGC“ nur unter dem Gesichtspunkt, dass nur die häufigen Allele in Betracht gezogen werden, ansonsten sind noch 11 weitere DRB1*04er Allele mit diesem Motiv in der Datenbank), erfordert der Fall „GAT“ weitere Pyrosequencing Ergebnisse zur Allelidentifizierung. Die nächste wichtige Basenposition ist die 286, welche mit dem Sequenzierprimer DRB1-S-286 untersucht wird. Ein „A“ an dieser Stelle deutet auf das Allele *0402 und vier weitere Möglichkeiten, welche aber zu den seltenen Allelen gehören). Wird an der Position ein „C“ detektiert, ist eine Sequenzierung bis zur Base 308 erforderlich und Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 57 - zusätzlich die Information aus der Pyrosequencing-Reaktion mit dem Sequenzierprimer DRB1-S-339, um die weiteren Allele differenzieren zu können. Sollte an der Position 286 ein „T“ sein, kommen nur vier seltene *04er Allele in Frage. HLA-DRB1 PCR-Product Amp4 Pyro DRB1-S-256 Base position 256-258 GAT Base position256-258 GAC Pyro DRB1-S286 DRB1*040302 Base position 286 C DRB1*0401 DRB1*0407 DRB1*0408 299 308 A C G A G C DRB1*0405 Base position 286 A DRB1*0402 Pyro DRB1-S-339 Base position 344/345 GT Base position 256-258 AGC Base position 344/345 TG DRB1*040301 DRB1*0404 308 A C Abb. 3.8 - Auswerteschema für die Pyrogramme von Amplifikaten der Allelgruppe DR4 In Abbildung 3.9 sind Beispiele für Pyrogramme der Allele DRB1*0401, *0402, *0404 und *0407 mit dem Sequenzierprimer S-286 zu sehen. Die Pfeile kennzeichnen die polymorphen Basenpositionen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung ↓ ↓ a) C b) C c) C d) - 58 - ↓ ↓ T CC T GG A G C A T CCT GG A G T CCT ↓ ↓ ↓ G AAG C GGGCCG C A G A GG C GGGCCG A GGA G C A G A GG CGGGCC G A T CC T GGAA G A C G C GG T GG T C GG T A G T Abb. 3.9 - Pyrogramme verschiedener HLA-DRB1*04 Allele bei der Sequenzierung mit dem Primer DRB1-S-286. a) DRB1*0401, b) DRB1*0407, c) DRB1*0404, d) DRB1*0402. Die Pfeile deuten auf die polymorphen Positionen. Mit der Pyrosequencing-Strategie für HLA-DRB1 wurden zur Evaluation zunächst Laborstandard DNA-Proben und 30 DZA Proben erfolgreich typisiert. Weiter wurden zwei Studien mit 418 DNA Proben durchgeführt. Insgesamt wurden dabei ca. 30 verschiedene HLA-DRB1 Allele typisiert, das entspricht 77% der vierstelligen Allele, die mit einer Häufigkeit von über 0,1% in der europäischen Bevölkerung vorkommen. Die Methode wurde in der Veröffentlichung „New strategies for efficient typing of HLA class-II loci DQB1 and DRB1 by using PyrosequencingTM“ (Entz et al., 2005) zusammengefasst dargestellt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 59 - 3.3 HLA-B-Typisierung Zur Typisierung von HLA-B müssen die wesentlichen polymorphen Regionen untersucht werden, die in Exon 2 und 3 dieses Genortes liegen. Durch die Homologien der Klasse I HLA-Genorte A, B und C war es problematisch geeignete PCR-Primer zu erstellen, die spezifisch nur HLA-B Exon 2 amplifizieren und zugleich für das Pyrosequencing geeignete Templates vervielfältigen. Ein Abgleich (BLAST – Basic Local Alignement Tool) verschiedener Primer gegen eine Datenbank mit HLASequenzen zeigte, dass ein Großteil der theoretisch erstellten Primer auch an homologe Bereiche anderer HLA-Genorte binden können. Dadurch konnten bei den PCR Reaktionen auch andere Genomabschnitte mitvermehrt werden. Um dieses Problem zu umgehen wurde hier die zweistufige „nested“ PCR gewählt. Zunächst wird dafür ein größerer Abschnitt vermehrt, der sich über den Bereich von Exon 2 und 3 und die umgebenden und dazwischen liegeneden Intronbereiche erstreckt (Abb.3.10). Dieses erste PCR-Produkt wird dann als Vorlage zur Amplifikation der kürzeren Abschnitte für die Pyrosequenzierung verwendet. Das Exon 2 wird mit den Primern BEx2-76-F und BEx2-342-R amplifiziert und dann in 10 bis 12 Pyrosequencing Schritten sequenziert. Das Exon 3 wird mit dem Primern BEx3-F und BEx3-R vervielfältigt. Diese Primer liegen in den das Exon 3 umgebenden intronischen Bereichen. Es folgen 8-10 Pyrosequencing Schritte. Da die für das Exon 3 gewählten Primer keine unspezifischen Produkte amplifizieren, ist es auch möglich, eine direkte PCR unter Auslassung des „nested“ PCR-Schrittes durchzuführen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 60 - Ca. 1000 bp Int1-57-F BEx2-76-F Int3-37-R BEx3-F Exon 2 Exon 3 BEx3-R BEx2-342-R PCR-Produkt 266 bp PCR-Produkt 414 bp Pyrosequncing Pyrosequncing S-103 S-353 S-141 S-379 S-161/164 S-407/8/9 S-190 S-461 S-201/204 S-499 S-241 S-527 S-256 S-559 S-269 S-599 S-271 S-298 Abb. 3.10 - Typingschema HLA-B: In einer ersten PCR wird ein Bereich von ca. 1000 bp mit Hilfe HLAB spezifischer Primer im Intronbereich vermehrt. Das Produkt wird in den folgenden PCR Reaktionen als Template eingesetzt. Das Exon 2 wird mit den Primern BEx2-76-F und BEx2-342-R und Exon 3 wird mit dem Primern BEx3-F und BEx3-R amplifiziert. Diese Primer liegen in den das Exon 3 umgebenden intronischen Bereichen. Die Rückwärts-Primer sind am 5’Ende Biotin markiert. 3.3.1 Erarbeitung der Typisierungsstrategie Zur Typisierung der HLA-B Allele einer DNA-Probe müssen die Sequenzabschnitte Exon 2 und Exon 3 untersucht werden. Zur Amplifikation des Exon 2 wurde zunächst ein Primerpaar das alle HLA-B-Allele erfasst getestet („B-Ex2-F“ und „B-Ex2-R“). Die Pyrosequencing Resultate waren jedoch nicht zufrieden stellend, d.h. die Pyrogramme zeigten nicht die erwarteten Signalhöhen, die daraus ermittelten Sequenzen entsprachen nicht denen der vorliegenden Allele. Daher wurden zur Amplifikation des Exon 2 des HLA-B Genortes verschiedene Optimierungsversuche unternommen. Die erste Idee war, das Exon von 5’-Ende aus zu sequenzieren, um die Schleifenbildung zu verhindern. Es wurden die gleichen Primer verwendet, nur mit dem Unterschied, dass der entgegengesetzte Strang mittels Biotin markiert und isoliert wurde („B-Ex2AmpF-bio“ und „B-Ex2AmpR-o“). Die Pyrosequencing Reaktion erfolgte dann Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 61 - mit einem entsprechend reversen Sequnzierprimer „S-167rev“. Aber auch dieser Ansatz führte nicht zu akzeptablen Resultaten. Ein weiterer Versuch bestand darin, das Exon 2 in zwei Teilen zu amplifizieren. Dazu wurden Primer im konservierten Bereich zwischen den Basenpositionen 168 und 186 gelegt, einmal als Vorwärts- und einmal als Rückwärts- Primer („B-Ex2_186-R“ und „B-Ex2_168-R“). Die kurzen Amplifikate ließen sich im Pyrosequencing aber nicht zufrieden stellend untersuchen. Tabelle 3.8 - PCR-Primer für HLA-B, Primer der endgültigen Methode sind gelbmarkiert. HLA-B Int1-57-F Intron1 (36-57) HLA-B Int3-37-R Intron3 (36-58) Markierung aus IHWG GGGAGGAGCGAGGGGACCG/CCAG Protokoll 8-B IHWG GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT Protokoll 8-B BEx2-76-F BEx2-342-R BAmp08-F BAmp27-F BAmp35-F BAmp35G-F B-Ex2-F B-Ex2-R B-CL1320G-R B-Ex2AmpR-o B-Ex2AmpF-bio Exon2 Exon2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 76-96 323-342 79-97 79-97 79-97 79-97 74-93 322-343 320-339 322-343 74-93 TCCCACTCCATGAGGTATTTC GGCCTCGCTCTGGTTGTAGT CACTCCATGAGGTATTTCG CACTCCATGAGGTATTTCC CACTCCATGAGGTATTTCT CACTCCATGAGGTATTTGT GCTCCCACTCCATGAGGTAT CGGCCTCGCTCTGGTTGTAG CCTCGCTCTGGTTGTAGTAGC CGGCCTCGCTCTGGTTGTAG GCTCCCACTCCATGAGGTAT BEx3-F Intron2 (169-188) TTCAGTTGAGGCCAAAATCC BEx3-R B-Ex3-07-F B-Ex3-13-F B-Ex3-35-F Intron3 Int2/Exon3 Int2/Exon3 Int2/Exon3 (36-54) (-6)-357 (-6)-357 (-6)-355 GCCATCCCCGG/CCGACCTAT GCCAGGGGTCTCACACCCTC GCCAGGGGTCTCACACTTGG GCCAGGGGTCTCACATCA Name Lokalisation Position Sequenz 5’-Biotin 5’-Biotin 5’-Biotin 5’-Biotin 5’-Biotin selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt Schaffer und Olerup selbst erstellt selbst erstellt selbst erstellt Ein weiterer Optimierungsansatz war, durch unterschiedliche Vorwärtsprimer, die auf spezielle Sequenzmuster im vorderen Teil des Exon 2 passen, eine Amplifikationsstrategie ähnlich der für HLA-DRB1 zu erstellen. Die Primer BAmp07F, BAmp08-F, BAmp13/15-F, BAmp14-F und BAmp27-F in Kombination mit dem allgemein passenden Rückwärtsprimer BEx2-R amplifizieren jedoch bis auf BAmp27-F auch unspezifische Allele. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 62 - Eine weitere Möglichkeit, die ausprobiert wurde, besteht in der Verwendung „universeller“, nicht-human-kompatibler Primer (Aydin, 2005). Die spezifischen Primer für HLA-B Exon 2 wurden durch einen „universellen“ Sequenzteil (GTGACGTACTAGCAACG bzw. TAGCAGGATACGACTATC) verlängert, welcher nicht auf humane DNA passt. Zur PCR werden zusätzlich zu den verlängerten spezifischen Primern die passenden universellen Primer zu gegeben, von denen einer mit Biotin markiert ist. Da diese universellen Primer aus nicht human-komplementären Sequenzen bestehen, soll die Gefahr geringer sein, dass sie innerhalb des PCR-Produkts fälschlich hybridisieren und somit wird die Gefahr der Schleifenbildung reduziert. Die Pyrosequencing Reaktionen waren jedoch nicht zufrieden stellend. Die Intensität der Signale war zu gering, um die Pyrogramme auswerten zu können. Eine weitere Variante die zur Verbesserung der Pyrosequencing Reaktionen getestet wurde, war die Blockierung der 3’ Enden mit ddNTP (Utting, 2004). Diese Methode soll eine Alternative zur Zugabe von SSB-Protein darstellen. Dabei wird wie in Abschlitt 2.2.4 beschrieben, das 3’-Ende des Pyrosequencing Templates mit einem Didesoxynucleotid blockiert. Dadurch kann zwar nicht das Anhybridisieren an eine komplementäre Stelle verhindert werden, aber die Verlängerung wird unterbunden, so dass kein „self-priming“ stattfindet. Im Zusammenhang mit dem HLA-B Exon 2 wurde diese Methode ausprobiert, wobei die Resultate nicht zufrieden stellen waren. So wurde die auch sehr aufwendige Methode der Modifizierung für die Anwendung in diesem Zusammenhang wieder verworfen. Für die Typisierung von HLA-B Exon 3 wurden ebenfalls verschiedenen Möglichkeiten der Amplifikation ausprobiert. Es wurde zuerst eine gruppenspezifische Amplifikation mit drei verschiedenen Vorwärtsprimern (siehe Tabelle3.8) getestet. Die generische Amplifikation mit Primern in den Intronbereichen erwies sich jedoch als am besten geeignete Methode. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 63 - Die optimierte Pyrosequencing-Strategie zur Typisierung von HLA-B besteht aus folgenden Schritten: 1. 2. 3. 4. 5. Amplifikation eines Teils der HLA-B Region (Intron 1-Intron 3) Nested-PCR Exon 2 PCR Exon 3 (aus Amplikon 1 oder aus DNA) Pyrosequnzierung der polymorphen Bereiche Auswertung der Pyrogramme 3.3.2 Optimierte PCR-Bedingungen für HLA-B Wie schon eingangs des Kapitels 3.3 erwähnt, erwies es sich zur Untersuchung des HLA-B Exon 2 am günstigsten, den Bereich der Exone 2 und 3 zuerst mittels spezifischer, in den Intronbereichen liegende Primer („HLA-BInt1-57-F“ und „HLABInt3-37-R“) zu amplifizieren. Anschließend wurde mittels eines weiteren Primer Paares, das Exon 2 daraus amplifiziert. Die Pyrogramme zeigen im Vergleich zu den direkt aus DNA amplifizierten Proben deutlich weniger Hintergrund, was in diesem Fall durch die hohe Spezifität der äußeren Primer erreicht wird. In einer ersten PCR wird ein Bereich von ca. 1000 bp mit Hilfe HLA-B spezifischer Primer im Intron 1 und 3 vermehrt (Abb.3.10). Ein so langes PCR-Produkt ist jedoch als Template für das Pyrosequencing nicht geeignet. Dieses erste PCR-Produkt wird dann als Vorlage zur Amplifikation der kürzeren Abschnitte für die Pyrosequenzierung verwendet. Das Exon 2 wird mit den Primern BEx2-76-F und BEx2-342-R amplifiziert und dann in 10 bis 12 Pyrosequencing Schritten sequenziert. Das Exon 3 wird mit dem Primern BEx3-F und BEx3-R vervielfältigt. Diese Primer liegen in den das Exon 3 umgebenden intronischen Bereichen. Es folgen 8-10 Pyrosequencing Schritte. Da die für das Exon 3 gewählten Primer keine unspezifischen Produkte amplifizieren, ist es auch möglich, eine direkte PCR unter Auslassung des „nested“ PCR-Schrittes durchzuführen. Für die Typisierung von HLA-B Exon 3 wurden ebenfalls verschiedenen Möglichkeiten der Amplifikation getestett. Es wurde zuerst eine gruppenspezifische Amplifikation mit drei verschiedenen Vorwärtsprimern verwendet. Die generische Amplifikation mit Primern in den Intronbereichen erwies sich jedoch als beste Methode. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung 1. PCR DNA Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen 15-50 ng/µl Gene Amp10xPCR-BufferII, Applied Biosystems 25 mM, Applied Biosystems je 2mM, Sigma 10 mM, B-Int1-57-F 10 mM, B-Int3-37-R 5U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun - 64 - µl 2 2,5 2 1 0,5 0,5 0,2 16,3 25 PCR-Cycler-Programm: Denaturierung bei 98°C für 20 Sek., 8 Zyklen 98°C für 5 Sek., 65°C für 30 Sek., 72°C für 2 Min.; 32 Zyklen 96°C für 5 Sek., 60°C für 30 Sek., 72°C für 2 Min.; finale Elongation bei 72°C für 10 Min. 2. PCR Exon 2 PCR-Produkt 1 Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen B Intron1-B Intron3 10xPCR-Buffer, Invitek 50 mM, Invitek je 2mM, Sigma 10 mM, BEx2-76-F 10 mM, BEx2-342-R 5 U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun µl 0,5 2,5 2,5 1 0,5 0,5 0,2 17,3 25 PCR-Cycler-Programm: Denaturierung bei 95°C, 5 Min., 50 Zyklen 94°C für 30 Sek., 60°C für 30 Sek., 72°C für 1 Min. 30 Sek., finale Elongation 72°C für 10 Min.. 3. PCR Exon 3 DNA bzw. PCR 1 Puffer Magnesiumchlorid dNTPs Primer-F Primer-R Taq-Polymerase ddH2O Gesamtvolumen 15-50 ng/µl 10xPCR-Buffer, Invitek 50 mM, Invitek je 2mM, Sigma 10 mM, BEx3-F 10 mM, BEx3-R 5 U/µl, Applied Biosystems Aqua ad iniectabilia, Braun µl 2 /0,5 2,5 1,5 1 0,5 0,5 0,2 17,3/18,8 25 PCR-Cycler-Programm: Denaturierung bei 95°C, 5 Min., 50 Zyklen 94°C für 30 Sek., 60°C für 30 Sek., 72°C für 1 Min. 30 Sek., finale Elongation 72°C für 10 Min.. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 65 - 3.3.3 Pyrosequencing-Bedingungen von HLA-B Die Sequenzierprimer und speziellen Dispensierreihenfolgen sind in Tabelle 3.9 dargestellt. Die Pyrosequencing Reaktionen zur Untersuchung des HLA-B Genortes wurden ohne Einsatz von zusätzlichem SSB-Protein durchgeführt. In der Abbildung 3.11 sind zwei Pyrogramme gezeigt. Das PCR-Produkt des Exon 3 wurde mit dem Sequenzierprimer B-S-559 untersucht. Tab. 3.9 - Sequenzierprimer und Dispensationsreihenfolgen Sequenzierprimer Primer Sequenz (5’-3’) Dispensationsreihenfolgen B-S-103 GGTATTTCTACACC ATGTCGACTGTCGCTCTG B-S-140 GAGCCCCGCTTCA B-S-141 GAGCCCCGCTTCAT B-S-161 GTGGGCTACGTGGACG B-S-164 GCTACGTGGACGACA B-S-167rev GTCGAACCTCACGAAC B-S-190 AGGTTCGACAGCGAC TCAGTCAGTGACTACGTGACGAGC CTAGTCACGTGCTACGTGACGAGC TAGTCACGCATCGTCGCTGACAGTCGAGC CGCATCGTCGCTGACAGTCGAGC CTAGCGCTGTCTG TGCGATCGA AGTCGAGAGAGATCGACGCGCGCGCGATG B-S-197 AGCGACGCCGCGA B-S-201 GCGACGCCGCGAGTCC B-S-204 GCCGCGAGTCCGAG B-S-241 GATAGAGCAGGAGGGG B-S-256 CGGAGTATTGGGAC B-S-269 GACCGGAACACACAGA B-S-272 GACCGGAACACACAGATCT ATAGA CGAGAGAGAGATCGACGCGCGCGCGATG TAGAGATCGACGCGCGCGCGATGATGATAG CATGCAGCTATGACGCAGACGCA TGCGATCGTACA ATCTATGTCAGACTAGCACAGCA GCATCGAGACATACGACAGCAGACT CGAGAGTCTCTACTGCGCATCATGCGCTGC B-S-298 B-S-353 B-S-358-07 B-S-358-13 B-S-356-35 B-S-379 B-S-407 B-S-409 B-S-461 B-S-499 B-S-527 B-S-559 B-S-599 GCT CACACAGACT(G/T)ACCGA ATCCGCGGTCTCACA ACATGCAGTAGCGTATGTACTCGCT CATGAGGTATTTCTACACCTCCG TCAGTAGCGTATGTACTCGCT ATGAGG TATTTCTACACCGCCA TCAGTAGCGTATGTACTCGCT CACTCCATGAGG TATTTCT ATCAGTAGCGTATGTACTCGCT GTAC/TGGCTGCGAC TGCATGCGAC GGCGCCTCCTCCGCG CGCTGACTGACAGTATCATGCT CGCCTCCTCCGCGGG GCTGACTGACAGTATCATGCT CCCTGAACGAGGACC CTGCATGCTCTGACGCGCGACACGCGC GCGGCTCAGATC CATGCAGCGTCAGTGA GAGGCGGCCCGTG GATCGCGAGCAGCACTGAGAGCTA GCCTACCTGGAGGGC TGACTGTGCGTGAGTCGCT CCTGGAGAACGGGA CAGACGACTGCTGCA Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung Die Primer der gruppenspezifischen PCRs - 66 wurden auch als „spezifische Sequenzierprimer“ getestet. Die resultierenden Pyrogramme waren von geringer Qualität, es erscheinen hohe Hintergrundsignale. Da aber ablesbar ist, ob eine Anlagerung erfolgt ist oder nicht, können sie für die Auswertung aussagekräftig sein. Die optimierte Strategie für HLA-B wurde an laborinternen Kontrollproben, an DNAProben aus Ringversuchen gestestet. Nach der ersten Evaluation wurde die Strategie benutzt, um eine HLA-B Typisierung von 22 Proben von Roros vorzunehmen. Die erreichte Auflösung ist dabei sehr unterschiedlich. In den meisten Fällen kann eine Typisierung mindestens auf serologischen Niveau erreicht werden. G/C A/T G T G C G T GG A G T Abb. 3.11 Beispiele für Pyrogramme – HLA-B Exon3, Sequenzierprimer B-S-559 GGG C Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 67 - 3.4 Anwendungen der Pyrosequencing basierten Typisierungsstrategien 3.4.1 HLA-DRB1 Typisierung von Familien-Trios Für eine erste Anwendung der HLA-DRB1-Typisierungsstrategie wurdne DNA Proben von 90 Individuen untersucht. Dabei handelte es sich um 30 Vater-Mutter-Kind-Trios. Die Proben waren bereits mit einer generischen PCR-SSP Methode in Kombination mit der nicht-elektrophoretischen Auswertung auf PicoGreen-Basis (Hampe et al., 2004) vortypisiert, so dass die Allelgruppen bekannt waren. Die Proben sollten nun mit der Pyrosequencing Methode höher auflösend untersucht werden. Es wurde für die Proben eine mindestens vierstellige Typisierung erreicht, bis auf zwei Allele, welche wegen fehlendem DNA-Material nicht näher untersucht werden konnten. In einigen Fällen konnten sogar sechsstellige Ergebnisse ermittelt werden. Die Ergebnisse von 19 Proben wurden mit etablierten HLA-Typisierungsmethoden überprüft. Die Ergebnisse der Pyrosequencing-basierten Untersuchung konnten bestätigt werden. In einem der Fälle konnte mit der Pyrosequencing Methode eine unklare, zweideutige Allelkombination gelöst werden. Die Kombination DRB1*1101/1104, DRB1*1301/1302 lässt sich nur mit Hilfe einer allelgruppenspezifischen Amplifikation eindeutig auflösen. In vielen kommerziellen SBT-Kits, liegen die betreffenden Allele aber in der gleichen Gruppe. Mit der Pyrosequencing Methode ließ sich die Kombination auflösen. In Tabelle 3.10 sind alle Ergebnisse zusammenfassend dargestellt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 68 - Tab. 3.10 - HLA-DRB1 Typisierungsergebnisse von 30 Eltern-Kind-Trios. SSO bzw. SBT Kontrollen sind in der letzten Spalte vermerkt. Familie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Person 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 Allel 11) *15 *150101 *01 *010101 *15 *150101 *03 *0301 *12 *120101 *03 *0301 *11 *1101 *13 *1301/022) *11 *1101 *15 *1501 *11 *1101 *11 *1101 *13 *130202 *11 *1103 *13 *130202 *03 *030101 *03 *0301 *03 *030101 *01 *010201 *13 *1301 *01 *010201 *01 *010101 *03 *030101 *01 *010101 *13 *130101 *11 *1101 *07 *070101 *13 *130101 *13 *130101 *13 *130101 *15 *1501 *13 *130201 *15 *1501 *01 *010101 *03 *030101 *03 *030101 *11 *110101 *12 *1201 *12 *1201 *03 *030101 *15 *1501 *03 *0301 *01 *010101 *04 *0404 *03 *030101 *11 *1101 *01 *0101 *15 *150101 *01 *010101 *13 *130101 *13 *1301 *12 *1201 Allel 21) *13 *03 *03 *03 *13 *13 *04 *04 *04 *07 *07 *07 *04 *14 *14 *13 *03 *03 *04 *11 *13 *16 *03 *03 *07 *10 *10 *07 *15/*16 *15/*16 *04 *09 *09 *03 *13 *03 *04 *13 *04 *04 *04 *04 *11 *03 *11 *15 *13 *13 *15 *13 *15 *13 SSO/SBT control *1302 *0301 *0301 *0301 *1301 *1301 *040101 *040101 *040101 *0701 *070101 *0701 *040101 *1401 *1401 *110401 *0301 *030101 *0404 *1101 *1301 *160101 *0301 *0301 *0701 *100101 *100101 *0701 *162) SBT: *070101 SBT: *070101 SSO: *11,*14 SSO: *13,*14 SSO: *03,*11/13, SBT SSO: *03,*03 SSO: *03,*03, SBT SSO: *01,*16 SSO: *03,*03 3) *040101 *090102 *090102 *0301 *130101 *0301 *0408 *1301/022) *0408 *040101 *040101 *040101 *1101 *030101 *1101 *150101 *1301 *1301 *1501 *130301 *1501 *1301/022) SBT:*030101,*130101 SBT: *130101,*130301 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 *1301 *1201 *010101 *1201 *1302 *030101 *11 *13 *16 *13 *16 *11 *1101 *1301 *1601 *130201 *1601 *110101 *13 *130101 *13 *130302 3 20 *13 *12 *01 *12 *13 *03 2 19 2 3 1 2 3 1 *13 *130101 *11 *110101 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 *03 *08 *08 *11 *01 *01 *14 *11 *11 *04 *04 *04 *08 *11 *08 *03 *03 *03 *01 *04 *07 *14 *15 *14 *03 *15 *15 *07 *15 *15 *0301 *0801 *0801 *1101 *010101 *010101 *1401 *1101 *1101 *040101 *040101 *040101 *080202 *110101 *080202 *0301 *0301 *0301 *010101 *040701 *0701 *1401 *1501 *1401 *0301 *1501 *1501 *0701 *1501 *1501 *15 *14 *03 *15 *01 *15 *13 *01 *14 *07 *03 *07 *14 *07 *11 *13 *04 *13 *12 *07 *12 *04 *04 *04 *03 *07 *03 *12 *04 *12 *150101 *1401 *0301 *150201 *010101 *150201 *1302 *010101 *1401 *0701 *0301 *0701 *140101 *0701 *1101 *130101 *0404 *1301 *1201 *0701 *1201 *0401 *040101 *040101 *0301 *0701 *030102 *1201 *040101 *1201 - 69 - SSO:*03,*11/13 SBT: *030101,*110101 SSO: *13,*13 SBT: *130101,*130302 SSO: *13,*11 SBT: *110101,*130101 or *110401,*130201 SSO: *03,*15 SSO:*08,*03 SBT: *140101 SBT: *110101 SBT: *110101 1) Es wurden nur Allele in die Auswertung mit einbezogen, deren Frequenz über 0,1% in der europäischen Bevölkerung liegt. 2) Nicht ausreichendes DNA Material, es konnte nur eine Pyrosequencing Reaktion durchgeführt werden. 3) Nicht ausreichendes DNA Material, es wurde nur eine PCR-SSP-Analyse durchgeführt. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 70 - 3.4.2 Fall-Kontroll-Studie “Alopecia areata” Die Studie zum Thema Alopecia areata und HLA erfolgte als Kooperation mit der Universität Antwerpen (Prof. Marcus Nöthen, Dr.med. Bettina Blaumeiser). Es wurden 161 unverwandte Patienten mit Alopecia areata (AA) untersucht. Die Patientenproben wurden in zwei Dermatologischen Instituten, in Antwerpen und Düsseldorf gesammelt. Die klinischen Daten der Patienten wie der Alopecia-Typ, das Ersterkrankungsalter und der familiäre Hintergrund wurden erfasst. Von den 161 Patienten hatten 74 die Erscheinungsform „patchy“ Alopecia, d.h. sie waren von kreisrunden, kahlen Stellen der Kopfhaut betroffen. 12 der Patienten litten unter Alopecia totalis (AT), dem völligen Verlust des Kopfhaares. 73 Patienten waren von Alopecia universalis (AU) betroffen, was den Haarausfall des kompletten Körperhaares beinhaltet. Zwei Patienten litten unter einer Mischform (AT/AU). 27 % der untersuchten Patienten hatten Angehörige ersten oder zweiten Grades, die ebenfalls von Alopecia areata betroffen waren. Die Kontrollgruppe bestand aus 164 gesunden, unverwandten Blutspendern, die nach Geschlecht und Alter entsprechend der Patientengruppe ausgesucht wurden. Die DRB1-Typisierung wurde nach der unter 3.2 beschriebenen Methode durchgeführt. Für die Studie wurden zunächst alle Proben mittels der PCR-SSP in die entsprechenden DRB1-Allelgruppen eingeteilt. Ein Vergleich der Allelfrequenzen in Tabelle 3.11 zeigte, dass die gesunde Kontrollgruppe mit auffällig höherer Frequenz positiv für die vom Primer „DRB1-Amp3-3“ amplifizierten Allelgruppen DRB1*03, *11, *13, *14 war, während unter den Patienten Allele der Gruppe DRB1*04 häufiger gefunden wurden. Daher wurden für die zu diesen Gruppen gehörenden Proben weitere, höher auflösende Typisierungen vorgenommen. Die „DRB1-Amp3-3“ positiven DNA-Proben wurden auf die Zugehörigkeit zu den Gruppen DRB1*03 bzw. DRB1*11 mittels PCRSSP getestet. Dabei zeigte sich, dass die Allele der Gruppe DRB1*03 unter den gesunden Kontrollen deutlich häufiger vorkommen als unter den Patienten. Die Häufigkeit der Allele der Gruppe DRB1*11 weicht zwischen der Patienten- und der Kontrollgruppe nicht auffällig ab. Die DNA-Proben mit Allelen der Gruppen DRB1*03 und *04 wurden dann mittels Pyrosequencing auf vierstelligem Allelniveau typisiert. Zur statistischen Auswertung wurden neben dem generellen Vergleich von allen Alopecia areata Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe folgende Gruppen ausgewertet: Patienten mit „patchy“ Alopecia, Patienten mit AT, Patienten mit AU, Patienten mit einem Ersterkrankungsalter unter 20, Patienten mit einem Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 71 - Ersterkrankungsalter über 20, Patienten mit familiärer Geschichte von Alopecia areata und Patienten ohne familiäre Geschichte von Alopecia areata (Tab. 3.12). Tab. 3.11 - Frequenz von HLA-DRB1 Allelen der Alopecia areata-Patienten verglichen mit gesunden Kontrollpersonen HLA-DRB1 *01 *15, *16 *08, *12 *03, *11,*13, *14 davon *03 *0301 *0302 *03XX2) davon *11 *04 *0401 *0402 *0403 *0404 *0405 *0407 *0408 *04XX2) *07 *09 *10 2n = Allele in Kontrollen 39 58 20 Alleles in Patienten 41 58 16 % 12,7 18,0 5,0 ChiQuadrat1 0,11 0,01 0,40 p-Wert % 11,8 17,6 6,1 140 45 37 42,4 13,6 11,2 116 24 22 36,0 7,5 6,8 3,02 6,72 3,90 0,08 0,009 0,05 1 0,3 0 0 0 1 13,6 13,3 7,3 0,3 1,5 1,8 0,3 0,3 0,3 38 67 43 1 0 3 2 3 3 12 21 1 2 322 11,8 20,8 13,4 0,3 0 0,9 0,6 0,9 0,9 0,54 0,5 6,27 6,41 0 3,15 0,41 0 0,27 0,27 0,01 0,01 1 0,08 0,5 1 0,6 0,6 6,5 0,3 0,6 0,69 0 0 0,4 1 1 7 45 44 24 1 5 6 1 1 1 5 27 0 2 330 0,7 0,9 0,5 2 8,2 0 0,6 1) Ohne Yates Korrektur für Werte > 5, mit Yates Korrektur für Werte ≤ 5 DRB1*03- and DRB1*04-Subtyping nicht möglich, da keine ausreichenden DNAProben 2) Beim Vergleich zwischen Kontrollgruppe und Patienten fallen die Frequenzen zweier Allelgruppen als statistisch signifikant abweichend auf. Demnach treten Allele aus der Gruppe DRB1*03 bei Alopecia areata Patienten mit einer Frequenz von ca. 7,5% auf, in der gesunden Kontrollgruppe aber mit 13,6 % (p=0,009). Die Allelfrequenz von DRB1*04 ist mit 20,8% in Patienten eventuell signifikant höher als in Kontrollen mit 13,6% (p=0,01). Nach Unterteilung der Patienten in die erwähnten Untergruppen, werden die Werte für verschiedene Fälle noch deutlicher (Tabelle 3.12). 45% der Patienten mit dem Phänotyp AU sind Träger eines DRB1*04er Allels, während nur Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 72 - 23,6% der Kontrollpersonen ein solches Antigen tragen (p=0,0008), was nach der Klassifizierung (siehe Abschnitt 2.3) als hoch signifikant einzustufen ist. Speziell das Allel DRB1*0401 tritt bei den AU-Patienten bedeutetnd häufiger auf. Auch unter den Patienten mit einem Ersterkrankungsalter bis 20 Jahre ist die Allelfrequenz der *04er und speziell das Auftreten des Allels *0401 deutlich erhöht. Sie liegt hier bei 16% gegen über 7% in der Kontrollgruppe (p=0,002). Betrachtet man andererseits die Gruppen der Patienten mit einem höheren Ersterkrankungsalter als 20 findet man kaum Unterschiede zwischen den Allelfrequenzen in Kontrollen und Patienten. So ist hier für keine Allelgruppe ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Allelefrequenzen von Betroffenen und Gesunden zu erkennen. Ähnlich verhält es sich, wenn man die Gruppe der Alopecia Patienten ohne familiäre Fälle mit den Kontrollen vergleicht. Zwar ist hier die Allelfrequenz von DRB1*0401 mit 11,5% gegen 7,3% noch erhöht, aber nicht statistisch signifikant (p=0,1). Die Ergebnisse dieser Untersuchung werden in der Veröffentlichung „Investigation of the HLA-DRB1 locus in alopecia areata“ (Entz et al., 2006 accepted) beschrieben. Tab. 3.12 - Verteilung der Allele DRB1*0301 und DRB1*0401 in den verschiedenen Alopecia areata Untergruppen verglichen mit Kontrollen Untergruppe Kontrollen (N =165) patchy AA (N = 74) AT (N = 12) AU DRB1Allel *0301 *0401 *0301 *0401 *0301 *0401 *0301 *0401 *0301 Anzahl Personen 20 26 10 14 0 1 12 25 9 ChiQuadrat1) p-Wert exakter Fischer -Test 2.58 0.73 2.18 0.03 1.11 12.01 4.25 0.1 0.4 0.1 0.9 0.3 0.0005 0.04 0.12 0.44 0.074 1 0.38 0.00087 0.053 (N = 73) AA Erkrankungsalter < 20 (N = 79) 25 9.73 0.002 AA *0301 13 1.46 0.2 Erkrankungsalter > 20 (N = 82) *0401 17 1.51 0.2 AA familiär *0301 2 6.19 0.01 (N = 44) *0401 16 10.68 0.001 AA nicht-familiär *0301 20 1.21 0.3 (N =117) *0401 26 2.77 0.09 1) Ohne Yates Korrektur für Werte > 5, mit Yates Korrektur für Werte ≤ 5 0.0033 0.24 0.28 0.0046 0.0022 0.29 0.11 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 73 - 3.4.3 HLA-B Typisierung der Roro-Proben Mit Hilfe der Pyrosequencing Methode zur Typisierung von HLA-B Allelen wurden DNA-Proben aus einer Population aus Papua-Neuguinea vom Stamm der Roro untersucht. Es wurden 22 DNA-Proben typisiert. Die Ergebnisse variieren in der Qualität der Auflösung, wie in der Tabelle 3.13 gezeigt. Die zuvor für 11 der Proben bekannten Typisierungsergebnisse durch klassische Sequenzierung konnten nur zum Teil bestätigt werden. In drei Fällen wurde eines der beiden Allele bestätigt, in einem Fall wurden zwei abweichende Allele typisiert. Die in Mitteleuropa ausgesprochen seltenen Allele B*4010 und B*4011 kamen in den untersuchten Proben je zwei Mal vor, weitere Proben mit B*40 konnten nicht höher aufgelöst werden. Bei einigen RoroProben wurde versucht mit Hilfe der HSE-Methode noch eine höhere Auflösung zu erreichen. In vielen Fällen, waren die PCR-Produkte aber zu schwach und die Pyrogrmme nicht auswertbar. Tab. 3.13 - HLA-B Typisierungsergebnisse der Roro-Proben RORO 1 RORO 2 RORO 3 RORO 4 RORO 5 RORO 6 RORO 7 RORO 8 RORO 9 RORO 10 RORO 11 RORO 12 RORO 13 RORO 14 RORO 15 RORO 16 RORO 17 RORO 18 RORO 19 RORO 20 RORO 21 RORO 22 HLA-B Pyrosequencing Ergebnisse HSE/Pyrosequencing HLA-B SBTErgebnisse B*5110/31, B*5508/5601/02/04/07/08/09/11/14 B*4901/02/5001/02, B*51/5306/5606/7801/02/03 B*27, 56 2704, 5602/04 B*51/53, 52 nicht auswertbar 1521, 40 B*27/40, 3515/31/33 Allele nicht getrennt B*56, 40 4035, 5601 40, 5601 B*13, 15 B*4010 4010 B*13, 55/56 1301, 5602/04 B*56, 27 B*5601/02/04,4010 B*5502/04/13/16/5610/12, B*5508/5601/02/04/09/11 B*15/35/56, 55/56 B*1306?, 54/55/56/59 4004,5502 4006,5501/02/05 B*40, 53 nicht auswertbar 4011, 5302/04 B*13, 54/55/56/59 1301, 39 B*15/54/55/56, ? B*47/4053, 40/4431 nicht auswertbar B*40, 54/55/56 nicht auswertbar 4011, 5602/04 B*54/55/56/59, 27/40/47 nicht auswertbar 39, 40 B*55, 13/40/44/47 nicht auswertbar 40, 55 B*4010 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 74 - 3.4.4 Überprüfung von Haplotypspezifischen Extraktionen Die Methode der Haplotypspezifischen Extraktion ist eine recht neue Methode, an deren Optimierung weiter gearbeitet wird. Die Überprüfung einer erfolgreichen Alleltrennung, ohne eine komplette HLA-Typisierung ist eine praktische Anwendung der Pyrosequncing Methode. Sie ist gegenüber der Typisierung mit SSO oder SBT effizient, weil verhältnismäßig wenig HSE-Produkt verbraucht wird und die Durchführung schnell und vergleichsweise preiswert möglich ist. Es ist nur ein Pyrosequencing Schritt nötig, um an einer bekannten heterozygoten Position den Erfolg der Alleltrennung zu überprüfen. In Abbildung 3.12, oben ist das Pyrogramm einer heterozygoten Probe dargestellt. Aus dieser DNA Probe wurden in zwei HSE-Reaktionen die beiden Allele extrahiert und anschließend die DNA mittels REPLIg vervielfältigt. Das mittlere und das untere Bild zeigen die entsprechenden Pyrogramme der Proben. An den beiden zuvor heterozygoten Positionen sind jeweils nur noch die homozygoten Konstellationen zu erkennen. Die Pyrosequencing Methode wird routinemäßig im Forschungsprojekt „Forensic Haplotyping“ zur Überprüfung der erfolgreichen Alleltrennung nach HSE eingesetzt. DNA 21564 B*08, *52 REPLI-g DNA21564 HSE B539A (B*52) REPLI-g DNA21564 HSE B559C (B*08) Abb. 3.12 - Pyrogramme vor und nach HSE, PCR B-Ex3, Sequenzierprimer B-S-599. Oben: Pyrosequencing Analyse einer heterozygoten DNA-Probe mit den Allelen B*0801 und B*5201. Mitte und unten: Pyrogramme der Einzel- Allele. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 75 - 4. Diskussion In dieser Arbeit wurden Pyrosequencing-Strategien für die Typisierung der HLAGenorte HLA-DQB1, -DRB1 und –B erarbeitet. Die Anwendungsmöglichkeiten der Methode liegen im Bereich von Krankheitsassoziations- und Populationsstudien. Diese Studien erfordern in Abhängigkeit von der Fragestellung keine hoch auflösende Typisierung, aber einen hohen Probendurchsatz mit möglichst guter Automation und geringem DNA Verbrauch. 4.1 Sensitivität der Methode Pyrosequencing wurde ursprünglich zur Anwendung in der SNP-Typisierung entwickelt, also zur Sequenzierung sehr kurzer DNA-Abschnitte mit weitgehend bekannter Sequenz, die idealerweise nur an einer Position Polymorphie aufweisen. Beim Einsatz des Pyrosequencing zur Analyse längere Sequenzen mit mehreren polymorphen Basenkonstellationen ergeben sich Schwierigkeiten, wie absinkende Signalhöhen und aufkommender Hintergrund. Durch den Verdünnungseffekt, der dadurch eintritt, dass immer wieder Nukleotid zugesetzt wird, sind nach einer längeren Sequnzierstrecke Enzym und Substrat nicht mehr in der ursprünglichen Konzentration im Reaktionsmix vorhanden, was sich negativ auf die Signalintensität auswirkt. Die Signalhöhen sind oft nicht mehr genau proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide, was durch die Überlagerung durch Hintergrundsignale zu Stande kommen kann. Durch sogenannte „Schleifen“ im Templatestrang, so wird das Anhybridisieren des 3’-Endes an den Strang bezeichnet, können starke Signale entstehen und die Sequenzierung überlagern. Durch den Einsatz von SSB lassen sich viele dieser Signale reduzieren oder beseitigen (Ronaghi, 2000). Auch eine Variation der Dispensationsreihenfolge kann derartige Probleme lösen. Die Leselänge des Pyrosequencing ist immer abhängig von der Qualität des Templates und der Basenzusammensetzung der speziellen Region. Die Erfahrung zeigt, dass bei der Analyse von unbekannten, heterozygoten Sequenzen etwa 30 Basen weit gelesen werden kann, Sequenzinformation in weiter entferntem Bereich sollte skeptisch betrachtet werden und nur unter Vorbehalt zur Typisierung herangezogen werden. Bei homozygoten Amplikons, die durch allelspezifische PCR oder durch haplotypspezifische Extraktion erreicht werden, können aber auch oft längere Abschnitte zuverlässig gelesen werden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 76 - Zur Optimierung der Pyrosequencingreaktionen wurden verschiedene Versuche unternommen. Variiert wurden die Menge der zur Aufreinigung eingesetzten Dynabeads, die Menge des PCR-Produktes und der Menge an zugesetztem SSBProtein. Die Verdopplung der PCR-Produktmenge, also der für die Pyrosequencingreaktion zur Verfügung stehenden Templatemenge war insbesondere bei schwachen PCR-Produkten erfolgreich. Eine größere Menge Dynabeads ist dann sinnvoll, wenn das PCR-Produkt besonders intensiv erscheint und mehr ssDNA während der Aufreinigung extrahiert werden soll. Der Einsatz von SSB-Protein erwies sich im Falle von starken Hintergrundsignalen oft als hilfreich wie bei den DRB1Anwendungsbeispielen. Die Menge muß allerdings für die jeweilige Anwendung optimiert sein. Zu viel SSB-Protein verursacht zu kleine Signalhöhen. Als Alternative zum SSB-Proteinzusatz wurde die Blockierung der 3’ Enden mit ddNTP ausprobiert (Utting, 2004). Dabei wird das 3’-Ende des Pyrosequencing Templates mit einem Didesoxynucleotid blockiert. Dadurch kann zwar nicht das Anhybridisieren des 3’-Endes an eine komplementäre Stelle verhindert werden, aber die Verlängerung wird unterbunden, so dass kein „self-priming“ stattfinden kann. Das Verfahren ist zwar sehr effizient und sicher günstig in Fällen, in denen eine Variation der Primer nicht möglich ist, aber zur routinemäßigen Anwendung ist es zu aufwendig. Jedes PCR-Produkt muss modifiziert werden, was einen weiteren Schritt bedeutet, der grade in Betracht einer Anwendung im Hochdurchsatz kompliziert wird. Im Zusammenhang mit dem HLA-B Exon 2 wurde diese Methode als zu aufwendig eingeschätzt. Bei der großen Zahl an bekannten Allelen und der daraus resultierenden enormen Anzahl an möglichen Allelkombinationen ist eine eindeutige hochauflösende Typisierung nicht in allen Fällen möglich. Bei der Optimierung der Typisierungsstrategie wurden vor allem die in der europäischen Bevölkerung häufigen Allele berücksichtigt, die mit einer Häufigkeit von über 0,1% auftreten. Eine Möglichkeit Ambiguitäten aufzulösen, sind Prozesse, die es ermöglichen, die Allele getrennt von einander zu untersuchen, wie die allelspezifische Amplifikation oder die Anwendung der Haplotyp-spezifischen Extraktion. Bei der Untersuchung unbekannter DNA-Proben mit dem Ziel einer hochauflösenden Typisierung sollten immer alle möglichen Sequenzierungsschritte durchgeführt werden. In anderen Fragestellungen, z.B. der genaueren Untersuchung spezieller Abschnitte nach vorangegangener Vortypisierung durch andere Methoden oder der Überprüfung einer HSE kann es auch Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 77 - ausreichen, lediglich eine oder wenige spezielle Sequenzierschritte durchzuführen, was sowohl zeitlich, als auch ökonomisch günstig ist im Vergleich zu einer „kompletten“ Typisierung. Der Probendurchsatz der HLA-Typisierung mittels Pyrosequencing ist in erster Linie durch die Auswertung limitiert. Die Auswertung durch die Pyrosequncing Software beschränkt sich auf einen einzelnen SNP (alte Software) bzw. auf maximal 7 polymorphe Positionen (neue Software), wobei eine manuelle Überprüfung nötig ist. Der Schritt der Allelzuordnung, also der Vergleich zwischen gefundenen Sequenzen und bekannten Sequenzen in der Datenbank wird bisher von Hand gemacht und ist daher sehr zeitaufwendig. Die Entwicklung einer Software zur Unterstützung der Pyrosequncing-basierten HLA Typisierung steht noch aus. 4.2 HLA-Klasse II-Typisierung Die beiden HLA Klasse II Loci DQB1 und DRB1 unterscheiden sich wie schon beschrieben sehr stark in ihrer Komplexität. Zur Untersuchung des DQB1-Genortes, mit derzeit 69 bekannten Allelen (Stand 11.01.2006) genügt eine generische Amplifikation mit anschließenden Pyrosequencing Schritten. Für die DRB1-Typisierung (429 bekannte Allele) wurden allelgruppenspezifische PCR-Schritte vorangesetzt. Dadurch wird einerseits eine Vortypisierung erreicht und in vielen Fällen die homozygote Sequenzierung des Alleles erreicht. Für die HLA-DQB1-Typisierung gilt, dass die häufigen Allele der Gruppen DQB1*02, DQB1*03 und DQB1*04 mit der Pyrosequencing Strategie generell gut zu typisieren sind. Die Differentierung der Gruppe *05, speziell die Unterscheidung zwischen DQB1*0502 und DQB1*0503 und der Gruppe DQB1*06 speziell die Unterscheidung zwischen den Allelen DQB1*0604 bis DQB1*0609 erfordert sehr lange Leselängen von über 40 Basen mit Sequenzierprimer DQB1-S-229. Theoretisch mögliche Sequenzierprimer, welche sich näher an den betreffenden variablen Resten befänden, weisen eine starke Tendenz zum Mißpriming an anderen Stellen des Amplikons auf. Sollte in diesem Abschnitt eine höhere Auflösung verlangt sein, z.B. beim Verdacht, dass sich dort die Ursache für eine mögliche Assoziation befindet, schlagen wir in der Veröffentlichung (Entz et al., 2005) eine weitere PCR und einen Sequenzierprimer zur Sequenzierung des Abschnitts in 5’-Richtung vor. Mit Hilfe dieser zusätzlichen Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 78 - Untersuchung wäre die spezifische Auflösung aller polymorphen Positionen in diesem Bereich möglich. Wenn die beiden Allele bei der HLA-DRB1 Typisierung in unterschiedlichen Amplifikationsgruppen liegen, verhält es sich so, dass die Allele „einzeln“ im Pyrosequencing untersucht werden können. Diese quasi homozygoten Amplifikate erzeugen Pyrogramme, welche lange Leseweiten erlauben und gut auszuwerten sind. Alle Allele mit einer Frequenz über 0,1% in der europäischen Population können in diesem Fall eindeutig typisiert werden. Gehören beide Allele zur gleichen Amplifikationsgruppe, müssen die Auswertungen der Pyrogramme besonders sorgfältig erfolgen. Alle Möglichkeiten von Permutationen der polymorphen Sequenzmotive zwischen den beiden Allelen müssen dann in Betracht gezogen werden. Bei der Anwendung der HLA-DRB1 Analyse in 30 Kernfamilien, wurden zunächst alle bekannten Allele in der Auswertung mitgeführt. Durch Vergleich der Sequenzen aus den Pyrogrammen und den bekannten Allelen wurde im Auschlußverfahren ausgewertet. Aus den sich ergebenden Allelen wurden dann die „seltenen“ Allele ausgeschlossen, wodurch jeweils nur ein Ergebnis übrig blieb. Durch die bekannten Familienstrukturen ergab sich eine vererbungsbasierte Kontrolle. Außerdem wurden 19 Proben zusätzlich mit konventionellen HLA-Typisierungsmethoden überprüft. Bei der Alopecia-Studie wurden die Patienten und Kontrollen im ersten Schritt mittels PCR-SSP typisiert und anschließend nur die statistisch auffälligen Allelgruppen mit der Pyrosequncing-Strategie höher auflösend untersucht. Ein protektiver Effekt von DRB1*03, der schon aus vorangegangenen Studien anderer Arbeitsgruppen mit polnischen (Broniarczyk-Dyla, 2002) und türkischen Patienten (Akar, 2002) berichtet wurde, konnte bestätigt werden. Die Untersuchung bestärkt auch die Hinweise aus anderen Studien, mit Patienten aus Nordamerika (kaukasoide), Großbritanien, Dänemark und der Türkei, dass das Allel DRB1*0401 in der europäischen Population ein Risikofaktor für AA darstellt (Frentz, 1986; Ødum, 1990; Duvic, 1991; Zhang, 1991; Colombe,1995, 1999; de Andrade, 1999; Akar, 2002). Besonders deutlich war der Effekt in der Gruppe der Patienten mit Alopecia universalis, mit einem p-Wert von 0,0005 zu erkennen. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 79 - Auch bei den Patienten, bei denen die Erkrankung in einem frühen Alter erstmals auftrat (Ersterkrankungsalter bis 20 Jahre) tritt das Allel *0401 deutlich häufiger auf (p=0,002). Vergleicht man die Gruppe der Patienten mit einem höheren Ersterkrankungsalter als 20 mit der Kontrollgruppe, findet man kaum Unterschiede zwischen den Allelfrequenzen in Kontrollen und Patienten. Hier ist für keine Allelgruppe ist ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Allelefrequenzen von Betroffenen und Gesunden zu erkennen. Wenn man die Gruppe der Alopecia Patienten ohne familiäre Fälle mit den Kontrollen vergleicht, finden sich keine statistisch signifikanten Assoziationen. Für andere, laut Literatur möglicherweise assoziierte Allele wie DRB1*07, *11, *12, *13, *14, *15 und *16 konnten in dem hier untersuchten Patientenkollektiv keine Hinweise gefunden werden (Averbakh, 1986; Frentz, 1986, Orecchia, 1987; Ødum, 1990; Duvic, 1991; Welsh, 1994; Colombe, 1995; Colombe, 1999; de Anrade, 1999; Kavak, 2000; Broniarczyk-Dyła, 2002). Das bestärkt die Annahme, dass sich die krankheits-begünstigenden Allele je nach Population unterscheiden. 4.3 HLA-Klasse I-HLA-B Eine Strategie zur Typisierung der HLA-Klasse I-Loci zu erarbeiten, erwies sich als deutlich schwerer, als für die Klasse II-Loci. Die Vielfalt an Allelen ohne die günstige Clusterung der Polymorphismen, wie sie am DRB1 Locus vorliegt, und eine Gruppenbildung durch allelgruppenspezifische Amplifikation ermöglicht, machten die Entwicklung einer Typisierungsstrategie mittels Pyrosequencing wesentlich aufwendiger. Die Vielzahl der Sequenzübereinstimmungen mit anderen HLA-Loci und die Problematik der repetitiven Sequenzmotive innerhalb der HLA-B Exone stellten hohe Anforderungen an das Primerdesign. Ausprobiert wurden allelgruppenspezifische Amplifikationen mit verschiedenen spezifischen Primern, eine Amplifikaton des Exon 2 in zwei Teilen, die reverse Sequenzierung, eine Verlängerung der Primer durch einen nicht-human-kompatiblen Teil und die Blockierung der 3’ Enden mit einem Didesoxynukleotid. Die Ergebnisse waren aber nicht zufrieden stellend. Es wurden unspezifische Abschnitte mit vermehrt oder es erschien ein starker Hintergrund, hervorgerufen durch Schleifenbildung des Templatestrangs. Die auftretenden Probleme konnten erst durch die Einführung einer „nested-PCR“ gelöst werden. Dies bedeutet zwar einen zusätzlichen Amplifikationsschritt, der aber zu qualitativ hochwertigen Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 80 - Pyrogrammen führt. Die Pyrosequencing Strategie für HLA-B führt anders als die Strategien für die Klasse II Genorte nicht immer zu hoch auflösenden Ergebnissen. Im Allgemeinen werden die Allele zweistellig typisiert. Bei der Untersuchung der Roro-Proben wurden für die Hälfte der Allele (22 Proben) mindestens zweistellige Ergebnisse erreicht. Die Besonderheit der Proben liegt darin, dass die Blutproben unter Feld-Bedingungen auf Papua Neuguinea gesammelt wurden und bereits seit mehreren Jahren im Tiefkühlfach lagern. Daher ist die aus diesen Blutproben gewonnene DNA zum Teil stark degradiert und nur noch bedingt für „klassische“ HLA-Untersuchungsmethoden einsetzbar. Durch die schlechte Qualität der Proben war eine frühere Untersuchung mit anderen HLA-Typisierungsmethoden für 11 der 22 Proben ohne Ergebnis geblieben. Mit der Pyrosequencing-Strategie konnten alle 22 Proben typisiert werden, allerdings nicht alle mit gleicher Auflösung. Die zuvor gewonnenen Ergebnisse aus der klassischen Sequenzierung wurden zum großen Teil bestätigt. In einigen Fällen (Ro4, Ro9, Ro16 und Ro20) wurden abweichende Allele bestimmt. Auffällig ist, dass die in Mitteleuropa so gut wie gar nicht vorkommenden Allele B*4010 und B*4011 in den 22 Proben je zwei mal erscheinen, weitere HLAB*40er Allele konnten nicht weiter aufgelöst werden. Wie in Tabelle 4.1 gezeigt kommen B*40er Allele im asiatischen Raum eher vor, als im europäischen. Speziell bei den Ozeaniern sind die Allele B*4010 und B*4011 eher anzutreffen, als in anderen Populationen (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/ihwg.cgi). Tabelle 4.1 Allelfrequenzen von HLA- B*40-Allelen Europäer Ozeanier Süd-OstNord-OstAsiaten Asiaten B*40 0,059 0,232 0,214 0,145 *4001 0,049 0,144 0,165 0,045 *4002 0,008 0,064 0,036 0,072 *4003 0 0 0 0,003 *4006 0,002 0,013 0,012 0,021 *4008 0 0,002 0 0 *4010 0 0,005 0,001 0 *4011 0 0,002 0 0,001 *4012 0 0,002 0 0 *4014 0 0,002 0 0 *4019 0 0 0 0,003 Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/ihwg.cgi Australier 0,261 0,092 0,169 0 0 0 0 0 0 0 0 Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 81 - 4.4 Vergleich mit anderen HLA-Typisierungsmethoden Die erarbeiteten Protokolle zur Pyrosequencing-basierten HLA-Typisierung können je nach Fragestellung eine Ergänzung oder eine Alternative zu den herkömmlichen HLATyping Methoden darstellen. Ein Vorteil liegt in der Schnelligkeit, grade für die Untersuchung kurzer Abschnitte ist die Pyrosequencing basierte Methode schneller in der Durchführung und günstiger, als die konventionelle Sequenzierung. Im Unterschied zu SSO- und SSP-Methoden liefert die Pyrosequenzierung echte Sequenzdaten und könnte daher gegebenenfalls auch Mutationen in den Sequenzen direkt erfassen. Der DNA-Verbrauch für die Typisierung ist verglichen mit der SSP-Methode recht gering, lediglich bei der HLA-DRB1 Typisierung ist er durch den vorgeschalteten gruppenspezifischen SSP-Schritt vergleichbar, wobei bei der reinen SSP-Typisierung durch die Vielzahl an Primerkombinationen mehr DNA in höherer Konzentration verbraucht wird, als bei der Pyrosequencing Strategie. Der Pyrosequencing-Ansatz für HLA-B ist andererseits durch den „Nested-PCR“-Schritt besonders sparsam im DNAVerbrauch. Der Vorteil der Pyrosequencing Methode im Vergleich zum SBT liegt in den kurzen PCR-Produkten, so dass sich auch bereits degradierte DNA noch zur Typisierung verwenden lässt. Ein Nachteil der Pyrosequencing-basierten Typisierungsmethode liegt derzeit in der Auswertung. Die Pyrosequencing-Software ermöglicht nicht die Auswertung langer, heterozygoter Sequenzen, mit einer Vielzahl polymorpher Positionen. Die manuelle Auswertung der Pyrogramme dauert bei einer kompletten Typisierung vergleichsweise lange und stellt die zeitliche Limitierung dar. Eine Zuordnung ermittelter Sequenzdaten zu den HLA-Allelen wird ebenfalls manuell vorgenommen. Je nach Laborausstattung ist ein Einsatz im Hochdurchsatz möglich, wobei die Auswertung mittels einer entsprechenden Software Grundlage sein muss. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 82 - 5. Zusammenfassung Der MHC ist durch seine Funktion eine für die Diagnostik und Forschung äußerst wichtige Region im humanen Genom. Die Untersuchung von HLA-Genorten stellt daher ein wichtiges Instrument in der molekulargenetischen Praxis dar. Die Pyrosequencing-Technik ist gut geeignet, um kurze DNA-Abschnitte mit weitgehend bekannter Sequenz schnell und effizient zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Pyrosequencing-basierten Methoden zur HLA-Typisierung. Exemplarisch wurden für drei wichtige HLA-Genorte Untersuchungsstrategien entwickelt. Die Vorgehensweise wurde jeweils auf die Besonderheiten der unterschiedlichen Genorte angepasst. Die polymorphen Regionen des Locus HLADQB1 werden grundsätzlich aus einer generischen Amplifikation heraus mit fünf anschließenden Pyrosequencing Reaktionen erfaßt. Zusätzlich ist die Amplifikation und Untersuchung des Exon 3 in speziellen Fällen vorgesehen. Der Genort HLA-DRB1 wird mittels einer Kombination aus gruppenspezifischen PCR-SSP und Pyrosequencing untersucht. Je nach Allelgruppe sind ein bis sechs Pyrosequencing Schritte zur Typisierung notwendig. Zur Untersuchung des Genortes HLA-B ist eine „nested PCR“Strategie erarbeitet worden. In einer ersten PCR werden die wesentlichen polymorphen Regionen umfassenden Exone 2 und 3 des HLA-B Genortes als ein zusammenhängender Abschnitt amplifiziert. In den beiden nachfolgenden PCRSchritten werden dann die Exone 2 und 3 getrennt amplifiziert. Zur Untersuchung des Exon 2 schließen sich zehn, zur Untersuchung des Exon 3 acht Pyrosequencing Reaktionen an. Die Strategien wurden an Standardproben validiert und in Kleinstudien angewendet. Es wurde eine Fall-Kontroll-Studie zur Untersuchung einer möglichen Assoziation zwischen HLA-DRB1 und Alopecia areata, sowie eine populationsgenetische Untersuchung mit Hilfe der entwickelten Typisierungsstrategie durchgeführt. Für die Haplotyp-spezifische Extraktion stellt die PyrosequencingMethode eine gute Möglichkeit dar, die Alleltrennung schnell und günstig zu überprüfen. Die Pyrosequencing Protokolle bieten eine sehr effiziente Alternative und Ergänzung zu den bestehenden HLA-Typisierungsmethoden. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 83 - 6. Anhang 6.1 Links zu Webseiten http://ncbi.nih.gov http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc/MHC.cgi?cmd=init http://ebi.ac.uk/imgt/hla/index.html http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html http://techsupport.pyrosequencing.com/v2/index.asp http://courses.washington.edu/bioinfo/BIR/ http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html http://dict.leo.org/ http://www.efiweb.org/links.html http://medweb.uni-muenster.de/institute/imib/lehre/skripte/biomathe/bio/vierf.html http://geneva.unige.ch/tools/data_analysis/dahla.php http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi http://rzblx1.uni-regensburg.de/ezeit/search.phtml?bibid=MBCB http://www.biotage.de 6.2 Abkürzungen AA Alopecia areata AS Aminosäure AT Alopecis totalis AU Alopecia universalis BLAST Basic Local Alignement Tool BSHI British Society for Histocombatibility & Immunogenetics (Bitische Gesellschaft für Histokompatibilität und Immungenetik) CCD charge coupled device (ladungsgekoppeltes Gerät) db database (Datenbbank) DGI Deutsche Gesellschaft für Immungenetik DNA Didesoxyribonucleinsäure DZA Deutscher Zellaustausch Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung efi European Federation for - 84 Immunogenetics (Europäische Föderation für Immungenetik) Ex Exon HIV Humanes Immundefizienz Virus HLA Humane Leukozyten Antigene HS high sensitivity (hohe Empfindlichkeit) HSP Hitzeschockprotein IEF Isoelektrische Fokussierung IHWG International Histocompatibility Working Group (Internationale Histokompatibilitäts Arbeitsgruppe) LCT Mikrolymphozytotoxizitätstest LD Linkage Disequilibrium (Kopplungsungleichgewicht) MHC Major Histocompatibility Complex (Haupt-HistokompatibilitätsKomplex) MS Mikosatellit PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) PNG Papua Neuguinea PPi Pyrophosphat SBT Sequenzierungs- basiertes Typing SNP single nucleotide polymorphism (Einzelnukleotidpolymorphismus) SSO Sequenz spezifische Oligohybridisierung SSP Sequenz spezifisches Priming TdT Terminale Transferase TNF Tumor Nekrose Faktor WGA Whole genome amplification (Geamtgenom Amplifikation) Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 85 - 6.3 Literaturverzeichnis Ahmadian A, Gharizadeh B, Gustafsson A.C. et al. Single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by PyrosequencingTM . Biotechnol Appl Biochem 2000: 280: 103-110. Akar A, Orkunoglu E, Sengül A, Ozata M, Gür AR. HLA class II in patients with alopecia areata Eur J Dermatol , 2002:12:236-239 Allen M, Eriksson I, Liu L, Gyllensten U. High resolution genetic typing of the class II HLA-DRB1 locus using group-specific amplification and SSO-hybridisation in microplates. Hereditas 1998: 129: 161-167. Andersson G, Larhammer D, Widmark E, Servenius B, Peterson PA, Rask L. Class II genes of the major histocompatibility complex: organisation and evolutionary relationship of the DRB genes. J Biol Chem 1987: 262: 8748-8758. Averbakh EV, Pospelov LE. HLA antigens of patients with alopecia areata. Vestn Dermatol Venerol. 1986;(1):24 Becker KG, Simon RM, Bailey-Wilson JE et al. Clustering of non-major histocompatibility complex susceptibility candidate loci in human autoimmune diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 1998: 95: 9979-9984. 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Pyrosequencing™ Strategies for HLA-Class II Highresolution Typing, NGFN-Meeting – Patient based studies, 23.-25. April 2003 München Entz P, Toliat MR, Hampe J, Jenisch S, Nürnberg P, Nagy M. PyrosequencingStrategies for HLA-Class II Highresolution Typing.11. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Immungenetik DGI/17th European Immunogenetics and Histocombatibility Conference, Mai 2003, Baden Baden Entz P, Nürnberg P, Nagy M.: PyrosequencingTM-based HLA-Typing, 19th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, 23.-26. April 2005 Istanbul, Türkei 6.5 Sequenzübersichten Zur Orientierung sind jeweils die Sequenzen der häufig vorkommenden Allele der bearbeiteten Gen-Loci mit PCR-Primern und Sequenzierprimern dargestellt. Die genauen Beschreibungen der Primer befinden sich im Ergebnisteil in den Tabellen 3.1, 3.3, 3.5, 3.6, 3.8 und 3.9. Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung - 91 - 6.5.1 Häufig vorkommende HLA-DQB1 Allele DQB1*0201 DQB1*050101 DQB1*050102 DQB1*050201 DQB1*050202 DQB1*0504 DQB1*0202 DQB1*030101 DQB1*030102 DQB1*030201 DQB1*030202 DQB1*0304 DQB1*030501 DQB1*030502 DQB1*030503 DQB1*0401 DQB1*0402 DQB1*060101 DQB1*060102 DQB1*060103 DQB1*0602 DQB1*0603 DQB1*060401 DQB1*060402 DQB1*060501 DQB1*060502 DQB1*0607 DQB1*0608 DQB1*0609 Exon2-> 110 120 ACTCTCCCG A GGATTTCGTG --------- - ---------****----- - ------------------ - ---------********* * ********-********* * ********** --------- - ------------------ - ---------********* * ********---------- - ---------********* - ------------------ - ---------********- - ---------********* - ---------********* - ------------------ - ------------------ - -----------C------ - ---------********* * ********** --C------ - ------------------ - ------------------ - ------------------ - ---------**------- - ------------------ - ---------********* * ********** ********* * ********** ********* * ********** --------- - ---------- 130 TACCAGTTTA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------T-------CT-------********** CT--------T-------------------------------------------********** ---------------------------- 140 AGGGCATGTG -----C--------C--------C--------C--------C---------------C--------C--------------------------C-----------------------------------------------------C-----**-C--------C----------------------------------------------C---********** ---------------------------- 150 CTACTTCACC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------********** ---------------------------- 160 AACGGGACAG --------G--------G--------G--------G--------G-----------------G--------G--------G--------G--------G--------C--------G--------C--------C--------C--T-----G--------G--T-----G--------G--------G--------G--------G--------G****----G--------G--------G--------G- 170 AGCGCGTGCG ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 180 TCTTGTGAGC GGG-----CGGG-----CGGG-----CGGG-----CGGG-----C----------TA-----C-TA-----C--------C--------C-TA-----CGGG-----CGGG-----CGGG-----CGGG-----CGGG-----C-TA-----C-TA-----C-TA-----C--------C------A-C------A-C------A-C------A-C------A-C------A-C------A-C------A-C- 190 AGAAGCATCT ---CA-------CA-------CA-------CA-------TA----------------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------TA-------CA-------CA-------CA-------TA-------TA-------CA-------CA-------TA----- 200 ATAACCGAGA ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DQB1*0201 DQB1*050101 DQB1*050102 DQB1*050201 DQB1*050202 DQB1*0504 DQB1*0202 DQB1*030101 DQB1*030102 DQB1*030201 DQB1*030202 DQB1*0304 DQB1*030501 DQB1*030502 DQB1*030503 DQB1*0401 DQB1*0402 DQB1*060101 DQB1*060102 DQB1*060103 DQB1*0602 DQB1*0603 DQB1*060401 DQB1*060402 DQB1*060501 DQB1*060502 DQB1*0607 DQB1*0608 DQB1*0609 210 AGAGATCGTG G---TA---G---TA---G---TA---G---TA-------TA------------G---TA--CA G---TA--CG---TA--CA G---TA--CA G---TA--CA G---TA--CG---TA--CG---TA--CA G---TA--CG---TA--CG---GA---G---GA---G---GA---G---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--CG---TA--C- 220 CGCTTCGACA ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 230 GCGACGTGGG ---------------------------------------------------------------A ---------A ---------------------------A ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- - 92 - 240 GGAGTTCCGG --T--A-----T--A-----T--A-----T--AT----T--A--------------T--A-----T--A-----T--AT----T--AT----T--A-----T--AT----T--AT----T--AT----T--AT----T--AT----T--AT----T--AT----T--AT----T--A---C --T--A---C --T--A-----T--A---C --T--A-----T--A-----T--A---C --T--A---C --T--A---- 250 GCGGTGACGC --A--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C------------------------------------------------------------------------------------------- 260 TGCTGGGGCT C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G ---------C--------C C--------C C--------C C--------C C--------C C--------C C--------C C--------C C--------G C--------G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G C--A-----G 270 GCCTGCCGCC -----TT-------TT------AG-------AG-------AG-----------------A--------A-----------------------------------------------------------T--A-----T--A--------A--------A--------A--------AT-------AT-------TT-------TT-------TT-------T--------AT-------TT-------TT--- 280 GAGTACTGGA ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 290 ACAGCCAGAA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------T-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 300 GGACATCCTG ---AG-------AG-------AG-------AG-------------------------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG----------------------------------------------------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG-------AG----- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung - 93 - DQB1*0201 DQB1*050101 DQB1*050102 DQB1*050201 DQB1*050202 DQB1*0504 DQB1*0202 DQB1*030101 DQB1*030102 DQB1*030201 DQB1*030202 DQB1*0304 DQB1*030501 DQB1*030502 DQB1*030503 DQB1*0401 DQB1*0402 DQB1*060101 DQB1*060102 DQB1*060103 310 GAGAGGAAAC ---G--GCC---G--GCC---G--GCC---G--GCC---GA-G-C----------------CC-------CC-------CC-------CC-------CC-------CC-------CC-------CC---GA-G-C---GA-G-C-------CC-------CC-------CC- 320 GGGCGGCGGT -----T--------T--------T--------T--------T------------------A-T------A-T------A-T------A-C------A-T------A-T------A-T------A-T-----T--------T----A----A-T-A----A-T-A----A-T- 330 GGACAGGGTG ---------------A--------A--------A-------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------CC--A -----CC--A -----C--------C--------C---- 340 TGCAGACACA ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------**** ---------- 350 ACTACCAGTT -----G--G-----G--G-----G--G-----G--G---******* --------------------------------------------------------------------------------------------------------G--G********** -----G--G- 360 GGAGCTCCGC --C-TA-----C-TA-----C-TA-----C-TA---********** -----------------------------------------------------------------------------------------------------C-T----********** --C-T----- 370 ACGACCTTGC GG--T-C--GG--T-C--GG--T-C--GG--T-C--********** ---------------------------------------------------------------------------------------------------GG--T----********** GG--T----- Exon2 Exon3-> 380 390 400 AGCGGCGAG T GGAGCCCACA GTGACCATCT --A--A--- - 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DQB1*0201 DQB1*0202 DQB1*030101 DQB1*030102 DQB1*030201 DQB1*030202 DQB1*0304 DQB1*030501 DQB1*030502 DQB1*030503 DQB1*0309 610 GACGTCTACA ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** -C-------- 620 CCTGCCACGT ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 630 GGAGCACCCC ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 640 AGCCTCCAGA ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 650 GCCCCATCAC ---------A--------********** A--------T ********** A--------A--------T ********** ********** A--------- 660 CGTGGAGTGG ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 670 CGGGCTCAAT -----------------G********** --------G********** --------G--------G********** ********** --------G- 680 CTGAATCTGC ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 690 CCAGAGCAAG ------------------********** ---------********** ------------------********** ********** ---------- 700 ATGCTGAGTG ------------------********** ---------********** ---******* ---******* ********** ********** ---------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung - 95 - 6.5.2 Häufig vorkommende HLA-DRB1-Allele DRB1*010101 DRB1*010102 DRB1*010201 DRB1*010202 DRB1*0103 DRB1*030101 DRB1*030102 DRB1*030201 DRB1*030202 DRB1*0304 DRB1*040101 DRB1*040102 DRB1*0402 DRB1*040301 DRB1*040302 DRB1*0404 DRB1*040501 DRB1*040502 DRB1*040503 DRB1*040504 DRB1*040701 DRB1*040702 DRB1*040703 DRB1*0408 DRB1*070101 DRB1*070102 DRB1*080101 DRB1*080102 DRB1*080401 DRB1*080402 DRB1*080403 DRB1*080404 DRB1*0805 DRB1*0806 DRB1*090102 DRB1*100101 DRB1*100102 110 CACGTTTCTT ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------****-------------C--------C---------------------------********** ---------------------------------------------------------------- 120 GTGGCAGCTT -------------------------------------GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--GA----G--------GG-------GG-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC********** -GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-AA----GA-GA-G--G--GA-G--G-- 130 AAGTTTGAAT -------------------------------------C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G--ACA---G----A-A-G--A-A-A-G-C-GG---G-C-GG---G-C-GG---G********** -C-GG---G-C-GG---G-C-GG---G-C-GG---G--------G--------G--------G- 140 GTCATTTCTT -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------T--------T------********---T--------T--------T--------T---------------------------------- 150 CAATGGGACG ------------------------------------------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------------------------------------------------------------------------------C--------C--------C------ 160 GAGCGGGTGC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 170 GGTTGCTGGA ---------------------------------------AC-------AC--------C--------C-------AC--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C----A---C----A---C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C-------AT---C------------------- 180 AAGATGCATC ------------------------------------C----A-T-C----A-T-G----A-T-G----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-----CT-T-----CT-T-C----A-T-C----ATT-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C---G--------C--G-----C--G-- 190 TATAACCAAG ------------------------------------C-------GC-------GC-------GC-------GC-------G---C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C-------------G--------G---------------------------------------------------------------------------------C--------C--------- 200 AGGAGTCCGT ----A------------------------------------AA-------AA-------AA-------AA-----------------A---A----A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------T--------T--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-------AA--------A--C ------A--C Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DRB1*110101 DRB1*110102 DRB1*110103 DRB1*110104 DRB1*110105 DRB1*1102 DRB1*1103 DRB1*110401 DRB1*110402 DRB1*120101 DRB1*120102 DRB1*130101 DRB1*130102 DRB1*130103 DRB1*130201 DRB1*130202 DRB1*130301 DRB1*130302 DRB1*1305 DRB1*1308 DRB1*140101 DRB1*140102 DRB1*1404 DRB1*140701 DRB1*140702 DRB1*150101 DRB1*150102 DRB1*150103 DRB1*150104 DRB1*150105 DRB1*150201 DRB1*150202 DRB1*150203 DRB1*1503 DRB1*160101 DRB1*160102 DRB1*160201 DRB1*160202 DRB1*1605 ---------------------------**----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------********-**-------*****---------------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C********** --------C--------C--------C**------C--------C****----C********C- -GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC-GA-T-CTC--------C--------C--------C--------C--------C--------C********** --------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C- -C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C-GG---G-C-GG---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C--C---G-C-GG---G-C--C---G-C--C---G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G******--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G---AGG--G- - 96 -----------------------------------------------------------------------------------T--------T-----------------------------------------------------------------------------------------------------------T------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------C-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C ---------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------A--------A--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C----- C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-G---CA-T-G---CA-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C---CA-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-C----A-T-- ---------------------------------------------------------------------------------C-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------G------------------C-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G-----T--G--------G--------G--------G--------G--------G--------G- ------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-------CT-C-----CT-C-----AA-------AA-------AA-------AA-------AA--------A--------A-------AA--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DRB1*010101 DRB1*010102 DRB1*010201 DRB1*010202 DRB1*0103 DRB1*030101 DRB1*030102 DRB1*030201 DRB1*030202 DRB1*0304 DRB1*040101 DRB1*040102 DRB1*0402 DRB1*040301 DRB1*040302 DRB1*0404 DRB1*040501 DRB1*040502 DRB1*040503 DRB1*040504 DRB1*040701 DRB1*040702 DRB1*040703 DRB1*0408 DRB1*070101 DRB1*070102 DRB1*080101 DRB1*080102 DRB1*080401 DRB1*080402 DRB1*080403 DRB1*080404 DRB1*0805 DRB1*0806 DRB1*090102 DRB1*100101 DRB1*100102 DRB1*110101 DRB1*110102 210 GCGCTTCGAC ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------G-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A--------A---------------------- 220 AGCGACGTGG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 230 GGGAGTACCG ------------------------------------------T--------T--------------------------T-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------T--- - 97 - 240 GGCGGTGACG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 250 GAGCTGGGGC --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A--------A------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 260 GGCCTGATGC ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C---------------AGC------AGC------AGC------AGC-------------------------------------------TC-------TC------AGC------AGC------------------------------------------AGC------AGC-------TC----------------------------A ---------A 270 CGAGTACTGG ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T----------------------------------------------------------------------------------------------C--------C--------------------------------------------------------------------------------C---------------------G--------G--------- 280 AACAGCCAGA ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 290 300 AGGACCTCCT GGAGCAGAGG ---------- ------------------- ------------------- --------------A---- ---AG-CGA---------- --------A---------- --------A---------- --------A---------- --------A---------- --------A---------- --------A---------- --------A-----A---- ---AG-CGA---------- ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- ---------A ---------- ------------------- --------------A---- ----G-C-------A---- ----G-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C-------T---- -----G------------- -----G------------- -----G--------T---- ---AG-C-------T---- ---AG-C--- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DRB1*110103 DRB1*110104 DRB1*110105 DRB1*1102 DRB1*1103 DRB1*110401 DRB1*110402 DRB1*120101 DRB1*120102 DRB1*130101 DRB1*130102 DRB1*130103 DRB1*130201 DRB1*130202 DRB1*130301 DRB1*130302 DRB1*1305 DRB1*1308 DRB1*140101 DRB1*140102 DRB1*1404 DRB1*140701 DRB1*140702 DRB1*150101 DRB1*150102 DRB1*150103 DRB1*150104 DRB1*150105 DRB1*150201 DRB1*150202 DRB1*150203 DRB1*1503 DRB1*160101 DRB1*160102 DRB1*160201 DRB1*160202 DRB1*1605 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------------------------T--------------------------------------------------------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T------------------------------------------------ - 98 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------A ---------A ---------A ---------A ---------A ---------A ---------A ------TC-------TC---------------------------------------------------AGC------AGC-------------------------C--------C--------C--------C--------C---------C--------C--------C-----------------C--------C-----------------C--------C--------C--------C--------C--------C--------C-- G--------G--------G--------G--------G--------G--------G-------------C--------C------------------------------------------------------------------------------------G---C----G---C----G---C----G---C----G---C----T--------T--------T-----------------T--------T-----------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----T--------T--------T--------A--------T--------T--------T--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------T--------A-----------------------------------------------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------T--------T--------------------------A---- ---AG-C-----AG-C-----AG-C-----AG-CGA---AG-CGA---AG-C-----AG-C-----AG-C-----AG-C-----AG-CGA---AG-CGA---AG-CGA---AG-CGA---AG-CGA---AG-C-A---AG-C-A---AG-C-----AG-CGA-----G--------G--------G--------G--------G----------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC-------GC---AG-C-----AG-C-----AG-C-----AG-C-----AG-C--- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DRB1*010101 DRB1*010102 DRB1*010201 DRB1*010202 DRB1*0103 DRB1*030101 DRB1*030102 DRB1*030201 DRB1*030202 DRB1*0304 DRB1*040101 DRB1*040102 DRB1*0402 DRB1*040301 DRB1*040302 DRB1*0404 DRB1*040501 DRB1*040502 DRB1*040503 DRB1*040504 DRB1*040701 DRB1*040702 DRB1*040703 DRB1*0408 DRB1*070101 DRB1*070102 DRB1*080101 DRB1*080102 DRB1*080401 DRB1*080402 DRB1*080403 DRB1*080404 DRB1*0805 DRB1*0806 DRB1*090102 DRB1*100101 DRB1*100102 DRB1*110101 DRB1*110102 310 CGGGCCGCGG --------------------------C-------------G-CG-----G-CG-----G-CG-----G-CG-----G-CG-----------------------------------A--------A-----------------------------------------------------A--------A--------A--------------G-CA-----G-CA-------CT-------CT-------CT-------CT-------CT-------CT----------------CT--------A---T--------C------------------------- 320 TGGACACCTA ------------------------------------------A--------AT-------A--------AT-------A----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GT --------GT --------------------------------------------------------------------------------GT ------------------------------------- 330 CTGCAGACAC ---------T--------T--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------G--------G--------------------------------------------------------------------------------G--------------------------------------------- - 99 - 340 AACTACGGGG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 350 TTGGTGAGAG ---------C--TG----C--TG-**** ------------TG-------TG-------------------------TG-------------------------TG-------TG-------TG-------TG-------------------------------------------------------------------------------------------**** ---------------------TG-------T--------T--------TG---------***** ---TG-------------------------------------------------- 360 CTTCACAGTG ------------------********** ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------G--------------------------G--------------------********** ------G--------G--------------------------G--------G--********** ---------------------------------------------------G--- 370 CAGCGGCGAG ------------------********** -----------------------***** ------------------------------------------------------------------------------------------* --------------A---------------------* ------**** ---------------------------********** ---------------------------------**** ---------* ---------********** ------------A------------------------------------------ 380 TTGAGCCTAA ********** ---------********** ----------CC-T----********** -CC-T-----CC-T----********** -CT-T---G********** -CT-T---G-CT-T---G********** -CT-T---G********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** -CC-T---G********** -CC-T----********** -CC-T----********** ********** ********** ********** ********** -CC-T---G--C-A----********** -CC-T-----CC-T----- 390 GGTGACTGTG ********** ---------********** ------------------********** ----------------*** ********** ---------********** ------------------********** ---------********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ---------********** ---------********** ---------********** ********** ********** ********** ********** ------------------********** ------------------- 400 TATCCTTCAA ********** ---------********** ------------------********** ---------********** ********** ------G--********** ------G--------G--********** ------G--********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ------G-C********** ---------********** -********* ********** ********** ********** ********** ********** ------G-C---------********** ----------********* Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung DRB1*110103 DRB1*110104 DRB1*110105 DRB1*1102 DRB1*1103 DRB1*110401 DRB1*110402 DRB1*120101 DRB1*120102 DRB1*130101 DRB1*130102 DRB1*130103 DRB1*130201 DRB1*130202 DRB1*130301 DRB1*130302 DRB1*1305 DRB1*1308 DRB1*140101 DRB1*140102 DRB1*1404 DRB1*140701 DRB1*140702 DRB1*150101 DRB1*150102 DRB1*150103 DRB1*150104 DRB1*150105 DRB1*150201 DRB1*150202 DRB1*150203 DRB1*1503 DRB1*160101 DRB1*160102 DRB1*160201 DRB1*160202 DRB1*1605 --C--------------------------------------------------------------C-----------------------------T-----------------------C-------------------------------------------------A--------A--------A--------A--------A------------------------------------------------------------------------------------C-----------------C-----------------C------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------T--------------------------------------------T-----------------------------------T--------------------------------------------------------------T-----------------T--------T--------T--------------------------T------------------------------------------------------------------------------------------------------------ - 100 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------TG-------TG-------TG-------TG----C--TG----C--TG-------TG-------TG-------TG----------------------------------------------------TG-------TG-------TG-**** ---TG-------------------------TG-------TG-------TG-------TG-------TG-------------------**** ------**** ---TG-------------------------------------**** --------** ------------------------------------------------------------G-----------------------------------------------------------------------G--------------------------------------********** ------------------------G--------------------------------------------------------********** ********** -------------------------*** 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B*270504 B*270505 B*270506 B*350101 B*350102 B*3502 B*3503 B*3504 --- ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------*** ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G----*** ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------ ------- ---------- ------G--- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G----*** ------- ---------- ------G--- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G----*** ------- ---------- ------G--- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G------- ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ------------ ------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G------- ------- ---------- ---------- --G------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G------- ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G----*** ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G------- ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G------- ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----G-----T- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- G--------*** ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- G---------T- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T---T- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T---T- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T--*** ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T----- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T---T- ------- ---------- ------C--- ---------- ---------- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T--*** ------- ---------- ------C--- ---------- ------T--- ---------- ---------- -A-C------ ---------- ----G-T----- ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------*** ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ------------ ------- ---------- ---------- --G--A---- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*3505 B*3508 B*3520 B*3701 B*3801 B*390101 B*390103 B*390104 B*3903 B*3905 B*390601 B*390602 B*400101 B*400102 B*400103 B*400104 B*4002 B*40060101 B*40060102 B*4101 B*4102 B*4201 B*44020101 B*44020102S B*440202 B*440203 B*440301 B*440302 B*4405 B*4501 B*47010101 B*47010102 B*4801 B*4901 B*5001 B*510101 B*510102 B*510103 B*510104 B*510105 B*510201 ----*** -T------*** ---------G--*** *** -T-T-T----------*** *** ---------T-T----------*** *** ----- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 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------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C--- - 103 --G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A-----G--A------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -G-------TG--------G-------TG--------G-------TG--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------A-C------ ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------------G--------G--------G-------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung - 104 - 180 190 200 210 220 230 240 250 CGTGAGGTTC GACAGCGACG CCGCGAGTCC GAGAGAGGAG CCGCGGGCG.....................C CGTGGATAGA GCAGGAGGGG CCGGAGTATT B*070201 B*070202 B*070203 B*070204 B*0705 B*0801 B*0804 B*0805 B*1302 B*1401 B*1402 B*15010101 B*1503 B*1507 B*1508 B*1509 B*1510 B*15170101 B*15170102 B*1518 B*180101 B*180102 B*2702 B*2704 B*270502 B*270503 B*270504 B*270505 B*270506 B*350101 B*350102 B*3502 B*3503 B*3504 B*3505 B*3508 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------A---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------GAT--C---------------------GAT--C------------GAT--C---GAT--C---------------------GAT--C---GAT--C------------GAC------GAC---------------------------------------------------------------------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC---- 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-------------------------------------------------------------------------A--------------------------A-----------------A--------A--------------------------A--------A--------------------------------------------------------------------------------------------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A--------A------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ --------------------------------------------------------------------------------------A--------A------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*3520 B*3701 B*3801 B*390101 B*390103 B*390104 B*3903 B*3905 B*390601 B*390602 B*400101 B*400102 B*400103 B*400104 B*4002 B*40060101 B*40060102 B*4101 B*4102 B*4201 B*44020101 B*44020102S B*440202 B*440203 B*440301 B*440302 B*4405 B*4501 B*47010101 B*47010102 B*4801 B*4901 B*5001 B*510101 B*510102 B*510103 B*510104 B*510105 B*510201 B*510202 B*5109 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-----------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-----------------A--------A------------------------------------------------------------------------------- - 105 ---GAC------GAC------------------------------------------------------------------------------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA----------------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA-------GA----------------GA-------GA-------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC------GAC---- 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-A-----------------------------------------------------------------------------------------A--------A-----------------A--------A--------A--------A--------A--------A-----------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-----------------A--------A--------A--------A-----------------A--------A--------A--------A--------A-------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------------------A--------A--------A-----A--A--------A--------A--------A--------A------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*520101 B*520102 B*520103 B*520104 B*5301 B*5501 B*5502 B*5601 B*570101 B*570102 B*570301 B*5801 B*7301 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- - 106 ---GAC------GAC------GAC------GAC------GAC---------------------------------GAT--C---GAT--C---GAT--C---GAC------------- --C------.....................--C------.....................---------.....................--C------.....................--C------.....................---------.....................---------.....................---------.....................--C------.....................--C------.....................--C------.....................--C------.....................---------.....................- -A--------A--------A--------A--------A-----------------------------------A--------A--------A--------A----------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung - 107 - 260 270 280 CA 290 T/G 300 310 320 330 340 343 350 GGGACCGGAA CACACAGATC TACAAGGCCC AGGCACAGAC TGACCGAGAG AGCCTGCGGA ACCTGCGCGG CTACTAC...AAC CAGAGCGAGG CCG GGTCTCA B*070201 B*070202 B*070203 B*0705 B*0801 B*0804 B*0805 B*1302 B*1401 B*1402 B*15010101 B*1503 B*1507 B*1508 B*1509 B*1510 B*15170101 B*15170102 B*1518 B*180101 B*180102 B*2702 B*2704 B*270502 B*270503 B*270504 B*270505 B*270506 B*350101 B*350102 B*3502 B*3503 B*3504 B*3505 B*3508 B*3520 -----------------------------------------------------------------------G--------------------------G--------G--------G-----------------------------------G--------G-----------------------------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------CG--------------------------G--------G--------G-----------------------------------G----G--AG----G--A---------------------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------T----A--A -C----A--A -T----A--A -C----A--A -G----A--A -G----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -T----A--A -G----A--A -G----A--A ATG------T ATG------T -G----A--A -C----A--A -C----A--A -G-------A -G-------A -G-------A -G-------A -G-------A -G-------A -G-------A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -C----A--A 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---------------------------------------------------------------C-GC--T-C------------------------------------------------------------------------T-GC--T-CT-GC--T-C---------------------------T-GC--T-CC-----T-CC-----T-CC-----T-CC-----T-CC-----T-CC-----T-C------------------------------------------------------------------------- -------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...--- 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B*510202 B*5109 B*520101 --------G--------------------------------------------------------------------------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G-----------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------------------------------------------------------------------------------G- G--------------------------------------------------------------------------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G-----------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------------------------------------------------------------------------------G--------- -C----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -G----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A ----------C----A--A -C----A--A -CG---A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -C----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -T----A--A -C----A--A - 108 -CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA----------------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA-------CA------- -T--------T--------------------------------------------T--------------------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T-----------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T-------- GA--------A-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A------C-A------C-A------C-A------C-A------C-A------C-A------C---------GA-------GA-----------------A-----------------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-------- C-----T-CT-GC--T-C---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C-GC--T-CC-GC--T-CC-GC--T-CC-GC--T-CC-GC--T-CC-GC--T-CC-GC--T-C---------C-----T-CC-----T-C---------T-GC--T-C---------T-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-C- -------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...--- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*520102 B*520103 B*520104 B*5301 B*5501 B*5502 B*5601 B*570101 B*570102 B*570301 B*5801 B*7301 --------G--------G--------G-----------------------------------------G--G-----G--G-----G--G-----G--G---------- G--------G--------G--------------------------------------------G----G--AG----G--AG----G--AG----G--A---------- -C----A--A -C----A--A -C----A--A -T----A--A ---------------------------ATG------T ATG------T ATG------T ATG------T -G-------A - 109 -CA-------CA-------CA-------CA---------------------------------CC--G----CC--G----CC--G----CC--G-------------- -T--------T--------T--------T-----------------------------------T--------T--------T--------T---------------T- -A--------A--------A-T------A-----------------------------------A--------A--------A--------A-------G--------- T-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-C---------------------------T-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-CT-GC--T-C---------- -------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...---------...--- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------A-- ------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung [Exon3 350 360 370 - 110 - 380 390 400 410 420 430 440 GGTCTCA CACCCTCCAG AGCATGTACG GCTGCGACGT GGGGCCGGAC GGGCGCCTCC TCCGCGGGCA TGACCAGTAC GCCTACGACG GCAAGGATTA B*070201 B*070202 B*070203 B*070204 B*0705 B*0801 B*0804 B*0805 B*1302 B*1401 B*1402 B*15010101 B*1503 B*1507 B*1508 B*1509 B*1510 B*15170101 B*15170102 B*1518 B*180101 B*180102 B*2702 B*2704 B*270502 B*270503 B*270504 B*270505 B*270506 B*350101 B*350102 B*3502 B*3503 B*3504 B*3505 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T----------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------TTGG----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A-------------- -------------------------------------------------------------------------CG-----TT-G-----TT-G-----T--G--------G-----------------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G--------G-------AT-----T-AT-----T-AT-----T-AT-----T-AT-----T-AT-----T-AT-----T--G-----T--G-----T--G-----T--G-----T--G-----T---------- --------------------------------------------------------------------------------C--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C--- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T------------------------------ -----------------------------------------------------------------------------------------T--------T--------------------------------------------------------------T--------T-----------------------------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T------------------------------------------------------- -------------------------------------A--------A--------A--------A--------A------TA -A------T-A------T--------C--------C--------C--------C-A----------------CC-----G-CC-----G---------C--------C--------CCC-----G-CC-----G-CC-----G-CC-----G-CC-----G-CC-----G-CC-----G---------C--------C-A---------------T-A---------------C- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*3508 B*3520 B*3701 B*3801 B*390101 B*390103 B*390104 B*3903 B*3905 B*390601 B*390602 B*400101 B*400102 B*400103 B*400104 B*4002 B*40060101 B*40060102 B*4101 B*4102 B*4201 B*44020101 B*44020102 B*440202 B*440203 B*440301 B*440302 B*4405 B*4501 B*47010101 B*47010102 B*4801 B*4901 B*5001 B*510101 B*510102 B*510103 B*510104 B*510105 B*510201 B*510202 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --T-A------T-A--------A-------------------------------------------------------------TTGG-----TTGG--------------------------------------------------TTGG-----TTGG-----TTGG----------------------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A-------TTGG--------------------------------TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG--- --G-----T--G-----T--G----CT--G--------G--------G--------G-----------------G-------CG-------CG-----T--G--------G--------G--------G-----T----------CG-----T-CG-----T--G-----T--------------------G--------G--------G--------G--------G--------G-----T--G--------G-----T--G----TT--G----TT-----------G-----T--G-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T- --------C--------C--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C-----------------------------------C--------C---------------------------------------------------------------- - 111 ------C--------C--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------C-----------------------------------C--------C------------------------------------------------------------------ ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------T--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T-----------------T--------T---------------------------------------------------------------- --------C--------C-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A------T-A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------A--------------G--------G--------G--------G--------G--------G-----------A------TA CC-----G-CC-----G--A--------A------TA -A------TA -A--------A--------A--------A--------A--------A--------A-------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------A--------A--------A-----------------A--------A--------A----- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*5109 B*520101 B*520102 B*520103 B*520104 B*530101 B*5501 B*5502 B*5601 B*570101 B*570102 B*570301 B*570302 B*5801 B*7301 ------------------------------------------------------------------------------------------- ---TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG-----TTGG----T-A-------TTGG-----TTGG-----TTGG----T-A------T-A------T-A------T-A------T-A-------TTGG--- -CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----T--G-----T-CG-----T-CG-----T-CG-----TGTG-----TGTG-----TGTG-----TGTG-----T--G-----T-CG-----T- -----------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------------------------------------------C--------A- - 112 ---------------------------------------------------C-----------------------------------------------------------------------C------------ ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T- -A--------A--------A--------A--------A---------------C-A------TA -A------TA -A------TA --------C--------CT -A--------A---------------C-A------T- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----A--------A--------A--------A--------A----------------------------------------------------------------------------------------------- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung 450 460 - 113 - 470 480 490 500 510 520 530 540 CATCGCCCTG AACGAGGACC TGCGCTCCTG GACCGCCGCG GACACGGCGG CTCAGATCAC CCAGCGCAAG TGGGAG...GCGG CCCGTGAGGC GGAGCAGCGG B*070201 B*070202 B*070203 B*070204 B*0705 B*0801 B*0804 B*0805 B*1302 B*1401 B*1402 B*15010101 B*1503 B*1507 B*1508 B*1509 B*1510 B*15170101 B*15170102 B*1518 B*180101 B*180102 B*2702 B*2704 B*270502 B*270503 B*270504 B*270505 B*270506 B*350101 B*350102 B*3502 B*3503 B*3504 B*3505 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 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--------------------------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C-----------------------------------------------------------------------------------------C--------C--------------------------------------A--------------------------------C--------C--------C--------C--------C--------C---- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------------------------------------------------------------------------T---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 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--------T--------T--------T-------T---------T-------T--------T---------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T--------T- Pyrosequencing-Strategien zur HLA -Typisierung B*3508 B*3520 B*3701 B*3801 B*390101 B*390103 B*390104 B*3903 B*3905 B*390601 B*390602 B*400101 B*400102 B*400103 B*400104 B*4002 B*40060101 B*40060102 B*4101 B*4102 B*4201 B*44020101 B*44020102 B*440202 B*440203 B*440301 B*440302 B*4405 B*4501 B*47010101 B*47010102 B*4801 B*4901 B*5001 B*510101 B*510102 B*510103 B*510104 B*510105 B*510201 B*510202 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Mein ganz besonderer Dank gilt Marion Nagy, bei der ich besondere Unterstützung zum Thema meiner Arbeit bekam und die mich in die HLA-Thematik einführte. Ihre freundliche Art zu motivieren und der konstruktive Austausch waren mir eine große Hilfe. Peter Nürnberg danke ich für seine Unterstüzung meiner Arbeit in den ersten zwei Jahren in seiner leider nun so nicht mehr bestehenden Arbeitsgruppe am MDC in Berlin-Buch. Dort hatte ich die Möglichkeit alles Wissenswerte über das Pyrosequencing zu erlernen. Mein besonderer Dank gilt beiden für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes in ihren jeweiligen Arbeitsgruppen. Allen Mitarbeitern beider Arbeitsgruppen, am MDC und an der Charité danke ich für ihre Hilfsbereitschaft, die freundliche Atmosphäre, für den Austausch, Anregungen und gegenseitge Unterstüzung. Für die Arbeitsgruppe am MDC: Mohammad Reza Toliat, Christian Becker, Jana Thiede, Björn Fischer, Jenny Pech, Kirsten Lenzen, Thomas Sander, Cornelia Dokup, Dominik Seelow und allen „Mitbewohnern“ des Doktorandenraumes „007“ Anja Brinckmann, Christian Astrosini, Annett Kramer, Katja-Martina Eckl, Dajana Neichel, Petra Hempel und Michael Radke. Für die Arbeitsgruppe an der Charité: Carmen Krüger, Petra Otremba, Marion Meschkat, Petra Anders, Corinna Hahne, Bärbel Henske, Sacha Willuweit, Lutz Roewer. Herrn Prof. Ulf Stahl danke ich für die Betreuung meiner Arbeit von Seiten der TU Berlin sowie seiner Hilfe bei der Anmeldung, Hinweise und Ratschläge zum Verfassen meiner Arbeit. Pyrosequencing-Strategien zur HLA –Typisierung - 120 - Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, - dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und allein unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Hilfen erarbeitet und verfaßt habe. - dass ich weder früher noch gleichzeitig ein Promotionsverfahren durchgeführt oder angemeldet habe. - dass mir die Promotionsordnung der TU Berlin zur Doktorin oder zum Doktor der Ingenieurwissenschaften in der Fassung vom 15. Dezember 1996, mit den Ergänzungen vom 26. Januar 2000 und 29. November 2000 bekannt ist. Berlin, den